MATERIAŁ DO BADANIA CYTOGENETYCZNEGO:

• krew żylna (2-10 ml) - heparyna

• fibroblasty (wycinek)

• szpik kostny (4 ml) - heparyna płynna sodowa

• krew pępowinowa (1-2 ml) - heparyna

• płyn owodniowy (15-20 ml)

• wycinki guza

• fragmenty tkanek (kosmówka, jajniki)

HODOWLA limfocytów krwi obwodowej:

2 hodowle dla jednego pacjenta!!!!

Czas 72 h

T 37*C

SKŁAD HODOWLI:

• 4 ml podłoża z antybiotykiem (np. gentamycyna)

• 1 ml surowicy

• 1 ml LF (czynnika wzrostu)

• 1 ml krwi pacjenta

HODOWLA komórek szpiku kostnego:

4 hodowle dla jednego pacjenta!!!!

Czas 24 h i 48 h

T 37*C

Przepływ CO2

SKŁAD HODOWLI:

• 5 (4) ml podłoża z antybiotykiem - np. Marrowmax

• (1 ml surowicy)

• 1 ml szpiku pacjenta

HODOWLA komórek z płynu owodniowego:

(badanie prenatalne)

2 hodowle dla jednej pacjentki!!!!

Czas 2-3 tygodnie

Temp. 37*C

Przepływ CO2

Dwie cieplarki

SKŁAD HODOWLI:

• 6 ml podłoża z antybiotykiem - np. Amniomax

• 1 ml surowicy

• 7 ml płynu owodniowego

Co około 7 dni wymiana podłoża

HODOWLA fibroblastów (tkanek):

2 hodowle dla jednego pacjenta!!!!

Czas: około 1 - 2 tygodnie

Temp. 37*C

Przepływ CO2

Roztwór tkanki w kolagenazie (2,5 mg/ml, T pok.)

SKŁAD HODOWLI:

• 7 ml podłoża do tkanek z antybiotykiem ( np. gentamycyna)

• 2 ml tkanki

izolacja

	krew	szpik	pł. owod.	tkanki
Kolcemid	2 krople 1,5-2 h	2 krople 1-1,5 h	7-8 kropli 3 h	7-8 kropli 3h
Zwir. podłoża	1500 g / 8 min (OSAD)
Szok osmotyczny KCl	8 min	30 min	20 min	20 min
Zwir.	1500 g / 8 min (OSAD)
Utrwalacz Metanol:kwas octowy 3:1	30 min 3x	30 min 3x	30 min 3x	30 min 3x
Zwir.	1500 g / 8 min (OSAD)
przechowywanie	-20*C	-20*C	-20*C	-20*C

GTG

• 15 metafaz o odpowiedniej rozdzielczości prążkowej

• Co najmniej 2 kariogramy

• 3 komórki z brakującym chromosomem lub dwie z dodatkowym = analiza 50 metafaz

Barwienia:

Symbol prążków	Technika barwienia	odczynniki	Zastosowanie
G	GTG	trypsyna, odczynnik Giemzy	Podstawowa, wszystkie chromosomy
C	CBG	Ba(OH)2, odczynnik Giemzy	Centromery, heterochromatyna chromosomów 1, 9, 16, Y
Ag-NOR	-	AgNO3	Organizatory jąderkotwórcze chr. 13, 14, 15, 21, 22
Q	QFQ, QFH	fluorochrom	Wszystkie chromosomy, satelity i centromery akrocentryków, warianty chromosomu Y. Fluorescencyjna
R	RBG	BrdU, odczynnik Giemzy	Wszystkie chromosomy, aberracje w regionach dystalnych
DAPI	-	DAPI	Wszystkie chromosomy, fluorescencyjna
RBA	-	BrdU, odczynnik Giemzy	Nieaktywny chromosom X

Biologia molekularna w medycynie. PWN 2001. pod red. J. Bala

Rozdzielczość prążkowa: liczba prążków w haploidalnym zestawie chromosomów

Najmniejsza rozpoznawalna aberracja:

7-10 x 106 pz przy rozdzielczości 400 prążków

2-5 x 106 pz przy rozdzielczości 850 prążków

Minimalny standard jakości preparatów chromosomowych w odniesieniu do wskazania do oceny kariogramu

wskazanie	Wymagana liczba punktów
		dla liczby prążków	dla jakości i li. pł. met	całkowita
Aneuploidia chromosomowa	2	1	3
Znana aberracja strukturalna	3	1	4
Niepow. rozrodu, dysmorfia, wady rozwojowe, opóźnienie rozwoju	5	1	6
Zespół mikrodelecji	7	1	8

Diagnostyka Laboratoryjna. Tom 37. 2001. Supl. I

Czas badania (górna granica):

• Płyn owodniowy: 21 dni (zalecane 17 dni)

• kosmówka: 20 dni

• krew - badanie zwykłe oraz inne tkanki nienowotworowe: 28 dni (zalecane 14 dni)

• krew, badanie pilne: 10 dni.

Diagnostyka Laboratoryjna. Tom 37. 2001. Supl. I