Mechanizm oporności drobnoustrojów na antybiotyki

1. Syntez enzymu (-ów)

• rozkład antybiotyku

• modyfikacja antybiotyku

2. Zmiana przepuszczalności ściany komórkowej bakterii lub zablokowanie transportu antybiotyku do wnętrza komórki.

3. Zmiana miejsca docelowego działania antybiotyku

• utrata lub zmiana białek wiążących penicyliny (PBP)

• zmiana w podjednostkach gyrazy DNA

Synteza nowych białek wiążących penicyliny (PBP 2a), która traci powinowactwo do B-laktamów i nie wiąże antybiotyków.

Wytworzenie zmienionego szlaku metabolicznego, który omija reakcję hamowania leku.

Aktywne usuwanie antybiotyku z komórki bakterii na zasadzie „pompy” (active efflux)

Pochodzenie oporności na leki

Oporność naturalna (wrodzona, gatunkowa, specyficzna) - zazwyczaj determinacja przez geny chromosomalne.

• brak receptora dla leku (Mycoplasma spp. - brak białek wrażliwych na penicyliny PBP)

• niskie powinowactwo cefalosporyny do receptorów (np. cefalosporyny do PBP Enterococcus spp.)

• ograniczenie przepuszczalności ściany komórkowej dla leku (np. złożona ściana komórkowa bakterii G (-) ogranicza penetrację leku o dużym ciężarze cząsteczkowym - makrolidy, glikopeptydy)

• wytwarzanie enzymów hydrolizujących antybiotyk.

Nabyta oporność

Oporność chromosomalna przekazywana prze komórki potomne

• samoistne mutacje genetyczne dla miejsc wrażliwych na lek lub układ transportujący lek przez błony, częstość mutacji 10⁵ - 10⁹

• nabycie genu oporności np. w wyniku transformacji obcogatunkowego DNA

Oporność zewnątrz chromosomalna

1. plazmidów ( czynnik R )

• przenosi i koduje oporność na kolka leków

• replikacja autonomiczna

• może być przenoszona do komórek baterii różnych szczepów i gatunków (koniugacja niekiedy transdukcja i transformacja)

• koduje również informacje na oporność na metale ciężkie, wirusy bakteryjne

transpozony - mogą przemieszczać się z chromosomu na plazmid i mogą stanowić jego integralną część. Jeśli lokalizują się na plazmidzie koniugacyjnym, mogą być przenoszone razem z nim do innych komórek.

sekwestracja inwersyjna (IS) - najmniejsze ruchome elementy genetyczne zawierające gen oporności

Oporność krzyżowa - niewrażliwość na wszystkie lub niektóre antybiotyki należące do tej samej grupy chemicznej (erytromycyny, oleandromycyny) lub w przypadku klas leków, których miejsca uchwytu dla antybiotyku znajdują się blisko siebie.

Oporność skojarzona - na więcej niż jedną grupę chemiczną, spowodowana mechanizmem oporności wynikającym z braku przepuszczalności błony komórkowej lub aktywnego wypompowywania leku z komórki.

Tolerancja - wynik braku aktywacji enzymów autolitycznych przez antybiotyk B-laktamow, który wykazuje spadek lub brak działania bakteriobójczego bez utraty działania hamującego (nie zmienia się wartość MIC, ale stosunek MBC:MIC >= 32)

Mechanizm oporności na wybrane gatunki antybiotyków:

1. Enzymatyczna hydroliza przez B-laktamazy

a) Chromosomalne cefalosporynazy klasy C (B-laktamazy AmpC)

• Wytwarzane prze bakterie G(-) (wyjątek Salmonella spp.)

• Są to enzymy swoiste dla określonych gatunków bakterii, oporne na działanie inhibitorów B-laktamaz (z wyjątkiem Bacteroides fragilis)

• Ekspresja cefalosporynaz chromosomalnych może być konstytutywna na niskim poziomie lub indukcyjna

Ekspresja konstytutywna, - gdy geny ulegają ekspresji w sposób ciągły na stałym poziomie niezależnie od obecności antybiotyków w środowisku.

Ekspresja induktywna, - gdy geny kodujące oporność ulegają ekspresji dopiero pod wpływem działania antybiotyku będącego induktorem.

B-laktamazy wykrywamy testem z krążkiem

IMP

ceftazydyna imipeniem (induktor) cefotoksyn

Wynik dodatni - ścięcie strefy zahamowania wzrostu przy krążku z cefalosporyną

Induktory np. imipenam, cefoksytyna, cefamandol, cefazolin

Mutanty z derepresorowanym genem B-laktamazy (AmpC) u nich następuje zmiana ekspresji indukcyjna na konstytutywną.

• produkowane na wysokim poziomie

• oporność na większość B-laktamów z wyjątkiem karbapenemów. Najczęściej ze zjawiskiem tym spotykamy się w warunkach szpitalnych w przypadku szczepów Enterobacter spp., Citrobacter, Serratia spp., P.aeruginasa, Proteus indolo (+), Morganella

b) plazmidowe B-laktamazy

• Penicylinazy (szczepy oporne na penicylinę S. Aureus, Bacillus cereus)

• B-laktamazy o szerokim spektrum substratowym (są wytwarzane gł. pałeczki G(-), enzymy mają ekspresję konstytutywna - ich synteza nie związana z obecnością antybiotyku w podłożu)

• klasyczne B-laktamy typu TEM i SHV - rozkład penicyliny i w mniejszym stopniu cefalosporyn I generacji. Występują najczęściej wśród klinicznych szczepów pałeczek G(-) opornych na penicyliny np. Haemophilus influenzae, E. Coli, Kliebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae i inne.

Wykrywanie test Cetynaowy: krążek z nitrocefiną (cefalosporyna hromogenna) wynik dodatni zmiana zabarwienia krążka.

• enzymy o rozszerzonym profilu substratowym ESBL (extendet spectrum B-laktamases)

• powstaje w wyniku mutacji w genie kodującym enzymy tj.: TEM-1, SHV-1

• hydroliza cefalosporyn (wyjątek cefanycyna), penicylina (wyjątek temodyna), monobaktamy

• mogą być wrażliwe na penicylinę z inhibitorem i karbapenem

Enterobacter, niektóre pałeczki niefermętujące, P. aurugines, Acinetobacter spp.

Wykrywanie:

Metoda1

Odczyt test przeglądowy wstępny (metoda krążkowo- dyfuzyjna z krążkiem cefpodoks, ceftazydym, cefotoksym, ceftraksom, astram)

Gdy stężenie mniejsze lub równe określa wartość...........................wykonujemy test potwierdzający, czyli krążek CAZ i CAZ + kw. klawulanowy;

CTX i CTX + kw. klawulonowy

Jeśli różna wielkość stref zahamowania wzrostu jest większa lub równa 5 oznacza wynik dodatni

Metoda2

Test dwóch krążków

CAZ AMC AMC CTX

Pojawia się strefy zahamowania wzrostu. Poszerzenie strefy zahamowania wzrostu.

Wynik (+) pojawienie się strefy zahamowania wzrostu pomiędzy augumentinem, a drugim krążkiem lub poszerzenie strefy zahamowania wzrostu pomiędzy augumentinem a drugim krążkiem.

• Metalo B-laktamy (MBL)

• kodowanie plazmidów (nabyte), B-laktamazy o aktywności karbapenowej wykazują jony Zn2+ jako kofaktory reakcji hydroksylacji B-laktamaz

• oporność na penicyliny, cefalosporyny, karbapeny

• nie hamowane prze inhibitory B-laktamaz, hamowane przez EDTA

• przenoszone pomiędzy szczepami P. aerunginos, Acinetobacter, a także szczepów gł. bakterii z rodzaju Enterobacteriae

• oporność naturalna (kodowana chromosomalnie) Stenotrophomona multop

2-AMP lub EDTA

CAZ IPM

Wynik dodatni poszerzenie strefy zahamowania wzrostu pomiędzy środkowym a bocznym krążkiem.

IPM IPM + EDTA

Wynik dodatni, różnica strefy zahamowania wzrostu między krążkami jest większa lub równa 7

Brak dostępu do receptora antybiotyku w komórce bakterii.

Wytwarzanie modyfikowanych białek PBP o obniżonym powinowactwie do antybiotyków B-laktamowych (S. Pneumoniae, N. Gonorrhoeae, H.influenzae)

W wyniku

• Mutacji w genie kodującym PBPs

• Pozyskanie fragmętu DNA opornych szczepów i ich rekombinowanie z genami (geny mozaikowe)

Hemophyilus influenzae - BLNAR - sczep nie wytwarza B-laktamaz opornych na ampicylinę, dla tej test cefinowy jest ujemny. Wykrywanie krążkiem z ampicyliną i augumentinem.

Fenotyp oporności S. pneumoniae na B-laktamy

• 5 białek PBP (1a, 2b, 2x, 2a, 2b) o wysokim i PBP 3a niskim ciężarze cząsteczkowym

• zmiana w białkach 1a, 2b, 2a, 2x, występuję oporność na penicyliny i wszystkie cefalosporyny

• zmiana w białkach 2b, 2x, oporność na penicyliny

• możliwy fenotyp przy średniej wrażliwości na penicyliny występuje oporność na cefalosporyny

SPPR - S. Pneumoniae, oporne na penicyliny

Wykrywanie metodą krążkowo-dyfuzyjną z oksacykliną, pozwala wykrywać szczepy wrażliwe na enzym SPPI. Nie można bezpośrednio interpretować średniej wrażliwości czy oporności, konieczne oznaczenie MIC (E-test lub metoda rozcieńczeniowa)

W przypadku szczepów izolowanych z zakażeń inwazyjnych i szczepy o obniżonej wrażliwości na penicyliny konieczne oznaczenie MIC dla cefotaksyn lub ceftriakson (g.III)

Wytwarzanie nowego białka PBP - 2a lub PBP - 2...... o niskim powinowactwie do antybiotyków B-laktamowych (Staphylococa)

Produkcja genu mecA obecnego jedynie u szczepów opornych na metacylinę (MRSA, MRCNS)

• szczepy wielooporne (wykrywana krzyżowa oporność z wszystkimi antybiotykami B-laktamowymi (in vivo) często oporność na makrolidy, linkozamidy, tetracykliny i aminoglikozydy)

• wykrywanie wrażliwości na glikopeptydy (wyjątek VISA, S. Aureus średnio wrażliwy na vankomycyne, hVISA - S. Aureus z obniżoną wrażliwością na vankomycynę VRSA

Metoda krążkowo-dyfuzyjna:

Oksacyein OX

Cefoksyd FOX

Lub metoda genetyczna PCR

Dla S.aureus można zastosować metodę przeglądową z oxacyiną na pożywce MHA (Milerhinton) + 4% NaCl

Metoda lateksowa (PBP-2a, PBP-2`) na wykrywanie lub podłoże hromogenne lub E-test

Do wykrywania VISA, VRSA - stosowanie metody przeglądowej z vankomycyną w podłożu BHIA (agar z wyciągiem mózgowo-sercowym)

Interpretacja wyników:

S. aureus

Cefoksyty MRS-1 MRCNS

=< 19 =< 24

Jeżeli z oxytocyną dla Staphylococów gdy wyjdzie średnio wrażliwy oznaczamy inną metodą

2. Wypompowywanie leków

3. Zmiana w przepuszczalności osłon zewnętrznych komórki bakterii G(-)

Glikopeptydy

Wykrywanie związków prekursorów peptydowych o niskim powinowactwie do wankomycyny, wynik działania zespołów genów (vanA, vanB, vanC, vanD, vanE)

VRE Enterococcus oporne na wankomycynę (najczęściej E. faecium)

hVISA, VISA, VRSA

Naturalna nieprzepuszczalność ściany komórkowej dla leku Enterobacteriace, .....................................................

Metody przeglądowe z wankomycyną i teikoplaniną na podłożu BHIA

Aminoglikozydy

Enzymy modyfikują lek (nukleotydyna acetyl fosfotransferyczny)

HLAR (High Level Aminoglycosyde Resistans). Występuje oporność na aminoglikozydy. Enterococcus

Metoda genetyczna i ........................ w podłożu BHIA

Zaburzenia energicznego transportu antybiotyku do wnętrza komórki (obniżenie przepuszczalność ściany komórkowej)

Modyfikacja celu (białka RS rybosomu 30S streptomycyna, rRNA kanamycyna)

Makrolidy

Zmiana w miejscu docelowym działania (białka 23S rRNA) determinowana przez gen erm. Zmiana w rybosomie powoduje dodatkowo oporność na linkozamidy i streptogramniy B (indukowaną lub konstytutywną, mechanizm MLS_B ) Staphylococcus, Streptococcus

Wykrywanie bezpośrednio z krążków

E CC/DA

Fenotyp indukcyjny - widoczne ścięcie strefy zahamowania wzrostu przy CC od strony E

Fenotyp MLSA konstytutywny - wielkość strefy zahamowania wzrostu świadczy o oporności przy obu krążkach

Fenotyp M - oporność tylko przy E

Enzymatyczna modyfikacja antybiotyku (estera, fosfotransformacja, glikozydotransformacja) - naturalna oporność. Enterobacteriacae

Naturalna nieprzepuszczalna ściana komórkowa dla leku Enterobacteriacae i pałeczek niefermętujących

Tetracykliny

Hamowanie transportu antybiotyku do komórek (mutacja białek transportowych błonowych).

Aktywne usuwanie antybiotyku z komórek (activw efflux). Determinowany genem nor

Modyfikacja antybiotyku.

Enzymatyczna modyfikacja miejsca docelowego działania (rybosom)

Chloramfenikol

Modyfikacja antybiotyku (acetylowa transformacja) chloramfenikol - nabyta oporność rodziny G(-) i G(+)

Modyfikacja celu rRNA

Chinoliny

Modyfikacja celu (modyfikacja w genie gyrazy DNA G(-), lub topoizomerazy IV G(+))

Zahamowanie transportu leku do komórki (zmiana parametrów)

Aktywne usuwanie leku z komórki, determinowane genem nor

Rifamycyny

Modyfikowanie celu (modyfikowanie genów kodujących podjednostkę B polimerazy RNA)

Sulfonamidy

Zmiana szlaku metabolicznego - synteza endogennego kw. foliowego (wykorzystanie egzogennego kw. foliowego). Nabyta oporność Enterococców na trimetoprim.

Modyfikacja leku.

CAZ

CTX

---