Wykład 1

Laboratorium:

• ludzie pracownicy/klienci

• Sprzęt, aparatura

• Substancje chem/podłoża

• Próbki do badań

• Wyniki badań

• Odpady biologicznie aktywne i nieaktywne

• Media (en el, gaz, H2O)

Rodzaje laboratoriów:

Zgodnie z systemem akredytacji:

*badawcze(mikrobiologiczne, fizykochem, GMO, sensoryczne, biotechnologiczne)

*wzorcujące

Ze względu na grupę ryzyka mikrobiologicznego:

I Małe ryzyko indywidualne i środowiskowe (podstawowe, typ I, nauczanie podstawowe, drobnoustroje o małym zagrożeniu dla człowieka)

II Umiarkowane ryzyko indywidualne i umiarkowane ryzyko środowiska (podstawowe typ I, nauczanie uniwersyteckie, publiczna służba zdrowia, podstawowa służba szpitalna, Bacillus cereus, Staphylococcus)

III Duże ryzyko indywidualne i niskie ryzyko środowiska (typ II, wyposażenie specjalistyczne, specjalistyczne laboratoria diagnostyczne, Salmonella, Shilegella, wirus HIV)

IV Duże ryzyko indywidualne i środowiska (typ III, max zabezpieczenie w laboratorium wyposaż. i środki ochronne, jednostki pracujące z groźnymi patogenami, wirus Ebola, Kongo)

Organizmy genet zmodyfikowane Dz. U. 2001.76.811 ustawa z dn 22.06.2001: użycie GMO, lista patogenów oraz ich klasyfikacja (4 kategorie patogenów).

Prawo RP, źródła: -konstytucja; -ustawy; -ratyfikowane umowy międzynarodowe;

-rozporządzenia.

Ust o systemie oceny zgodności z dn 30.08.2002: -prawo budowlane; -warunki techniczne, jakim powinny odpowiadać budynki i ich usytuowanie; -dopuszczalne stężenia i natężenia czynników szkodliwych dla zdrowia.

Ochrona środowiska i odpady, ścieki => prawo wodne.

Rozporządzenie Ministra Zdrowia => wymagania jakim powinno odpowiadać laboratorium medyczne.

Ustawa o systemie oceny zgodności. Celem ustawy jest:

*eliminacja zagrożeń stwarzanych przez wyroby dla życia lub zdrowia użytkowników i konsumentów oraz dla mienia i środowiska.

* znoszenie barier technicznych w handlu i ułatwienie międzynarodowego obrotu.

System oceny zgodności tworzą:

• Przepisy określające zasadnicze i szczegółowe wymagania dotyczące wyrobów;

• Przepisy oraz normy określające działanie podmiotów uczestniczących w procesie oceny zgodności.

W procesie oceny zgodności uczestniczą: producenci, ich upoważnieni przedstawiciele, importerzy, jednostki certyfikujące, jednostki kontrolujące oraz laboratoria.

Ocena zgodności:* obowiązkowa - określona przepisami;

* dobrowolna: - wyroby nie objęte obowiązkową oceną zgodności; -systemy zarządzania jakością, środowiskiem, bezpieczeństwem; - usługi; - kompetencje personelu.

Wykład 4

PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy; metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych; sekwencja wielokrotnego ogrzewania i chłodzenia.

Do reakcji wprowadza się:

• Matrycowy DNA;

• Trifosforan deoksyrybonukleotydów;

• Startery;

• Termostabilna polimerazę.

Mechanizm reakcji PCR: w wyższych temp (ok. 95°C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na pojedyncze łańcuchy. W temp niższej (ok. 45°C) przyłączają się do matrycy pary starterów. Podwyższenie temp do 72°C powoduje utworzenie się na matrycy z przyłączonymi do niej starterami kompleksu z polimerazą DNA wskutek tego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy.

Listeria monocytogenes limit 10²jtk

Staphylococcus aureus limit 10⁵jtk

Detekcja za pomocą FD-PCR: -pkt końcowy PCR; - pkty amplifikacji (amplikowy) są wykrywane po amplifikacji.

Modyfikacje metody PCR:

RT-PCR (Reverse Transcription): Odwrócona transkrypcja, używając RNA jako matrycy Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy użyciu odwrotnej transkryptazy.

Real-Time PCR: Do środowiska wprowadzane są znakowane (fluorescencyjne) nukleotydy, bądź sądy łączące się z DNA, które pozwalają na określenie ilości matrycy użytej do reakcji i ilości powstającego produktu. Produkty amplifikacji gromadzące się w czasie procesu są wykrywane w czasie amplifikacji.

Technika: 1 etap: przygotowanie próbki (rozdrobnienie); 2 etap: ekstrakcja DNA w PCR; 3 etap: amplifikacja; 4 etap: wykrycie (oznaczenie jakościowe i ilościowe).

Organizacja powierzchni laboratorium: 200m², właściwe pokoje dla każdego etapu analiz, drogi przemieszczania, nadciśnienie.

Impedymetria - metoda pozwalająca na ocenę liczby drobnoustrojów w pożywce poprzez obserwowanie zmian właściwości elektrycznych pożywki. Zmiany te zachodzą podczas wzrostu drobnoustrojów. Przewodność elektryczna pożywki pożywki odzwierciedla metabolizm drobnoustrojów.

Impedymetria ilościowa - Mierzy czas jaki mierzy od chwili rozpoczęcia badania to wystąpienia istotnej zmiany sygnału elektrycznego. Czas jest odwrotnie proporcjonalny do ilości komórek wprowadzonych do pożywki. Oznaczenie liczby komórek drobnoustrojów możliwe jest po wcześniejszym przeprowadzeniu wzorca.

Cytometria przepływowa - jest metodą diagnostyczną umożliwiającą oceną wielkości intensywności zabarwienia i intensywności fluorescencji badanych komórek. Metoda pomiaru pojedynczych komórek lub cząstek przepływających przez aparat w strumieniu cieczy.

Fluorymetria - wykorzystuje zjawisko emisji promieniowania fluoryscyjnego przez cząstki oznaczanego składnika. Intensywność emitowanego promieniowania jest proporcjonalna do stężenia składnika w badanej próbce.

Sonda molekularna - odpowiedni odcinek DNA ?wyznakowany? radioaktywnie. Wykorzystuje się zdolność sondy do hybrydyzacji z określoną sekwencją testowanego DNA.

Mikromacierz DNA, chip DNA - płytka szklana z naniesionymi ?polami? zawierającymi określone sekwencje DNA. Fragmenty te są sondami, które wykrywają przez hybrydyzację komplementarne do siebie cząsteczki DNA.

---