Temat 9 :

Transformacja genów do komórek bakterii metodą trójrodzicielskiej koniugacji.

1. Cel ćwiczenia.

Zapoznanie studentów z metodami wprowadzania genów do mikroorganizmów.

2. Zakres ćwiczenia.

Wprowadzenie genu gfp (ang. green fluorescent protein) do wybranych bakterii metodą trójrodzicielskiej koniugacji.

3. Cześć teoretyczna.

Transformacja jest procesem, w którym informacja genetyczna jest przekazywana do biorcy bez kontaktu komórek lub bez pośrednictwa faga. DNA wyizolowany z komórek dawcy jest aktywnie pobierany przez komórki biorcy . Wejście DNA do komórki biorcy zachodzi prawdopodobnie w odpowiednich miejscach.

Wysoką aktywność transformująca wykazuje DNA natywny dwuniciowy. Jednoniciowy albo zdenaturowany DNA jest mało aktywny w transformacji.

Wymiana odcinków DNA i replikacja prowadzi do powstania komórek transformantów o nowych właściwościach . Wydajność transformancji zależy od stężenia DNA i od kompetencji komórek biorcy. Stan kompetencji polega prawdopodobnie na wytwarzaniu białkowego czynnika kompetencji .

DNA w preparatach używanych do transformacji występuje zwykle we fragmentach około 1/200 długości chromosomu.

Wydajność transformacji jest to liczba powstałych kolonii bakterii opornych na antybiotyk uzyskana podczas transformacji bakterii 1 mikrogramem plazmidu.

Bakterie które przyjęły plazmid są selekcjonowane na pożywce zawierającej antybiotyk. Jest to możliwe , ponieważ w wektorze znajduje się gen nadający bakteriom oporność na zastosowany antybiotyk.

4. Wykonanie doświadczenia

Zadanie nr 1: Przygotowanie podłoża LB.

Odważamy na wadze analitycznej do kolby miarowej odpowiednio :

NaCl - 1g

Wyciąg drożdżowy - 0,5g

Tripton - 1g

Agar - 3g.

Uzupełniamy do 100 ml wodą destylowana , mieszamy i jałowymi podłoże przez 20 minut w szybkowarze. O wyjałowieniu rozlewamy po 20 ml jałowego podłoża na płytki Petriego, czekamy około 20 minut do zestalenia podłoża po czym podłoże suszymy w cieplarce w temp. 55°C przez ok. . 30 minut.

Zadanie 2 : Wykonanie koniugacji.

Mikropipetą pobieramy po 200 μl z całonocnych bulionowych hodowli dawcy , biorcy oraz szczepu E. coli RK600 z plazmidem pomocniczym , przenosimy do jałowych probówek typu Eppendorf i dodajemy 1 ml 0,9 % NaCl następnie wirujemy przez około 5 minut przy obrotach 134 tyś. Na minutę . Po odwirowaniu zlewamy supernatant i ponownie dodajemy 1 ml 0,9% NaCl, wirujemy i zlewamy supernatant, znów dodajemy 0,9 ml NaCl i przepipetowujemy. Następnie za pomocą pipety automatycznej pobieramy o 30 μl dawcy, biorcy oraz szczepu E. coli RK600 z plazmidem pomocniczym i mieszamy w jałowej probówce typu Eppendorf. Z mieszaniny tej pobieramy 50 μl zawiesiny i jako kropla przenosimy na płytkę Petriego z podłożem LB, pozostawiamy do wyschnięcia kropli. Podłoże inkubujemy przez 24 godziny w temp. 37°C.

Temat 10 :

Analiza transformantów Escherichia coli MM294 z genem gfp.

  1. Cel ćwiczenia.

Zapoznanie studentów z zastosowaniem konwencjonalnych i nowoczesnych technik analizy bakteryjnych transformantów.

2. Zakres ćwiczenia.

Wykonanie analizy stabilności i wydajności transformancji szczepu E. coli MM294 genem gfp.

3. Wykonanie doświadczenia.

Zadanie nr 1: Przygotowanie podłoża selekcyjnego

Kolejno odważamy na 1000 ml podłoża :

dopełniamy do 1000 ml woda destylowaną i jałowimy 15 min w szybkowarze.

Każda z grup musi przygotować 100 ml podłoża przeliczając odpowiednio.

Każda z grup przygotowuje 5 płytek Petriego dodając 19 ml podłoża selekcyjnego i 1 ml roztworu namycyny ciągle mieszając , czekamy do zestalenia podłoża następnie podłoże suszymy przez 15 min. w cieplarce.

Zadanie 2 :Przygotowanie hodowli bakteryjnej .

WYNIKI I WNIOSKI.