Ćwiczenie 5
Wykazanie aktywności peroksydazowej w materiale biologicznym.
Materiały:
Biokatalizatory: korzeń pietruszki, liście fasoli, ziemniak, igły sosny, bufor octanowy 0,05M (pH 5,6), 0,02 M roztwór pirogalolu, 0,06 roztwór H2O2
Wykonanie:
1 g materiału roślinnego zhomogenizować w moździerzu z 1-3 ml buforu octanowego i uzupełnić buforem do 10ml. Przenieść do sterylnej kolbki okrąglodennej.
Kolby wytrząsać przez 10 min, następnie odwirować 5ml zawiesiny.
Zlać supernatant do probówki (zostawić). Osad w probówce wirówkowej zalać ponownie 5 ml buforu, rozmieszać i odwirować.
Połączyć supernatanty.
Przygotować próby:
a. do szklanej probówki wprowadzić 0,9ml buforu octanowego, 0,5 ml r-ru pirogalolu, 500μl ekstraktu enzymatycznego, 0,5 ml H2O2.
b. do szklanej probówki wprowadzić 0,9ml buforu octanowego, 0,5 ml r-ru pirogalolu, 500μl ekstraktu enzymatycznego, 0,5 ml H2Odest
c. do szklanej probówki wprowadzić 0,9ml buforu octanowego, 0,5 ml r-ru pirogalolu, 500μl H2Odest , 0,5 ml H2O2
Wymieszać i próby inkubować przez 4 min w temp. 300C
Dokładnie po 4 min zmierzyć absorbancję roztworów przy λ=430nm.
Miarą aktywności enzymu (peroksydazy) jest różnica absorbancji próby a i b
Utlenienie pirogalolu w obecności peroksydaz
C=A/a*b (C- stężenie produktu mM, A- absorbancja, a- grubość kuwety, b=2.47 1/Mm*cm - milimolowy współczynnik absorpcji)
Mikrobiologia przemysłowa