Podstawy diagnostyki wirusologicznej.

Objawy kliniczne + badanie wirusologiczne które ma na celu:

Badanie wirusologiczne etapy:

1) Pobranie, transport i przechowywanie materiału diagnostycznego

2) Opracowanie materiału i zakażenie nim hodowli

3) Prowadzenie hodowli i wykazanie w niej obecności wirusa

4) Izolacja wirusa, określanie miana i identyfikacja

5) Oznaczenie miana przeciwciał w surowicy chorego

Ad 1:

-materiał pobierany dzieli się na płynny, półpłynny i stały

-pobiera się go jałowo

-materiał z którego później izoluje się wirusy pobiera się w pierwszych dniach choroby, z miejsc gdzie jest największe prawdopodobieństwo znalezienia wirusów.

-krew do oznaczania miana przeciwciał pobiera się 2 razy: na początku choroby i w czasie rekonwalescencji

-materiał musi być dostarczony jak najszybciej do laboratorium w naczyniu z lodem najlepiej w silnym zamrożeniu -25◦C

-środków chemicznych do konserwacji raczej się nie stosuje

-krwi do badań serologicznych nie zamraża się

Ad 2:

Materiał płynny

1)Dodać antybiotyk (penicylina, streptomycyna, nystatyna, tetracyklina)

2)Do lodówki na 1h

3)Odmrozić

4)Wirować

5)Zarażać hodowle

Materiał papkowaty (kał)

1)Dodać antybiotyk w płynie PBS

2)Do naczynia wrzucić kulki szklane i wstrząsa się na trzęsawce przez 1 h

3)Zamrozić zawiesinę -25◦C na 1h

4)Odmrozić

5)Wirować

6)Zakładać hodowle

Materiał stały (sekcyjny)

1)Dodać płynu z antybiotykami i średnioziarnistego piasku

2)Rozcierać

3)Odciągnąć płyn

4)Zamrozić

5)Odmrozić

6)Wirować

7)Zakażać hodowle

Zakażanie hodowli w Ad 3

Ad 3:

Hodowla

Wirusy musza być hodowane w żywych układach, obecnie stosuje się głównie hodowle komórkowe można tez stosować zarodki kurze i zwierzęta.

Rodzaje hodowli komórkowych:

-Pierwotna

Jednorazowa, np.: hodowla fibroblastów kurzych lub nerki małpy

-Ciągła (heteroploidalna)

Przygotowane z „unieśmiertelnionych” linii komórkowych dlatego mogą być pasażowane nieskończenie długo.

-Półciągłe (diploidalne)

Mogą być pasażowane 20-30 razy

Zakładanie hodowli komórkowych:

Polega na tym że hoduje się komórki uwolnione z tkanki przez zadziałanie trypsyną która rozpuszcza lepiszcze wiążące ze sobą komórki, potem się trypsynę odwirowywuje i dolewa płynu odżywczego. Są dwie metody takiej hodowli:

-hodowla komórek zawieszonych w płynie

-hodowla jednowarstwowa (tworzy się jedna warstwa komórek na szkle patrz hodowla fibroblastów kurzych skrypt str 111)

Płyny odżywcze w hodowlach komórkowych:

-podtrzymujące (2-5% surowicy)

-wzrostowe (5-20% surowicy)

Różnią się tylko zawartością surowicy a pozatym każdy z nich zawiera:

-Płyn podstawowy: aminokwasy, cukry, prekursory kw. Nukleinowych, sole mineralne, bufory, witaminy, barwniki

-Antybiotyki

-hydrolizat laktoalbuminy: bogate źródło subst. Odżywczych

-surowica: różnicuje płyny na podtrzymujące i wzrostowe, hamuje działanie trypsyny i stanowi środowisko do wymiany substancji

-sole wapnia: gdy komórki musza być przyklejone do szkła

Zakażanie hodowli:

1)Odciągnąć płyn wzrostowy (??)

2)Przepłukać hodowlę PBS

3)Nanieść badana zawiesinę na komórki

4)Pozostawić na kilka godzin

5)Odciągnąć zawiesinę

6)Przepłukać PBS i dodać płyn podtrzymujący

7)Zamknąć hodowle korkiem i do cieplarki

Pasażowanie hodowli komórkowych:

Przeniesienie komórek z jednego naczynia hodowlanego do drugiego. Zlewa się płyn odżywczy, dodaje trypsyne żeby rozbiła hodowlę dodaje nowego płynu odżywczego i rozlewa.

Wykrywanie wirusa w hodowli:

Obecność namnażających się wirusów można stwierdzić następującymi metodami:

-mikroskop elektronowy (ogładanie wirusów)

-mikroskop świetlny (obserwacja efektu cytopatycznego)

-metoda łysinkowa (dodaje się do hodowli agarozy lub metylocelulozy która hamuje rozprzestrzenianie się wirusów, potem dodaje się czerwieni obojętnej która barwi tylko komórki żywe - czyli tylko te które nie są zakażone wirusami.

-odczyn hemaglutynacji (wirusy które posiadają hemaglutyninę aglutynują dodana zawiesinę krwinek)

-odczyn hemadsorbcji (niektóre wirusy wbudowywują hemaglutynine w błonę komórkową zakażonej komórki, dodaje się krwinek i obserwuje się przyleganie krwinek do komórek)

-próba barwna Salka (zmiana barwy płynu odżywczego gdy są wirusy)

-metoda interferencji (gdy szukany wirus nie wywołuje efektu cytopatycznego, nadważa się hodowle wirusem ECHO który wytwarza efekt cytopatyczny - jeśli jest obceny szukany wirus to będzie on hamował ECHO i efektu nie będzie - np. szukanie wirusa różyczki)

-metody immunologiczne - szukanie wolnych antygenów wirusowych

Ad 4:

Izolacja:

1)Mechaniczne rozbicie komórek przez rozcieranie żeby uwolnić wirusy z komórek

2)Wirowanie

3)Oczyszczanie - metody:

Miareczkowanie

Określanie miano czyli ilość zakaźnych cząstek wirusa w 1ml zawiesiny tkanek zwierzęcia lub płynu komórkowego. Robi się szereg rozcieńczeń a potem szczepi się nimi zwierzęta i patrzy się co się z nimi stanie - na podstawie obserwacji stwierdza się dawkę efektywną ED50 czyli najmniejszą ilość czynnika działającego który wywołuje reakcję u 50% obiektów doświadczalnych.

Identyfikacja:

Etapy:

1)izolacja

2)określanie na podstawie właściwości:

3)identyfikacja serologiczna:

4)Inne:

Hybrydyzacja DNA - wykrywanie genomu wirusowego za pomocą hybrydyzowania wirusowego DNA z nicią komplementarna, skuteczność zwiększa się użyciem PCR.

4

dworzu 2005/2006