ASO-Analiza genu za pomoca oligonukleotydow specyficznych dla allelu.

METODA: wykorzystanie 2 oligonukleotydow(komplementarnego z sekwencja prawidlowego genu i 2-go komplementarnego ze znana mutacja w tym genie).W odpowiednich warunkach sondy ASO hybrydyzuja tylko z komplementarna sekwencja DNA. Hybrydyzacja ASO wykrywa prawidlowa kopie genu oraz kopie zmutowana powodujacą chorobę.

- stosujemy membrany nitrocelulozowe(filtry) na to mat. badany (DNA)

• unieruchomienie (met. termiczna lub chemiczna)

• do pieca hybrydyzowego(?) zalewa się sondy i inkubuje się

• hybrydyzacja

• odpłukuje się niezwiązana sondę

• wywołanie koloru przez dodanie awidyny z przeciwciałami lub izotypów(znaczników)

ZASTOSOWANIE: badanie chorób, u których podłoża leży 1 określona mutacja(niedokrwistość sierpowatokrwinkowa, niedobór α1-antytrypsyny)

ZALETY I OGRANICZENIA: wykorzystanie do bad.DNA zamplifikowanego technika PCR, pozwala na szybka i dokladna diagnostyke.Ale analiza możliwa tylko przy dokladnej znajomosci prawidlowej sekwencji oraz podloza molekularnego mutacji. Wykorzystanie metody ogranicza fakt iż w przyp. wielu chorob w kazdej rodzinie wyst swoista mutacja.

Met.ASO w bad niedokrwistosci sierpowatokrwinkowej(wykorzystuje się krwinki biale bo maja jadro kom. a w nim DNA.Krwinki biale poddaje się lizie i podgrzewa az do denaturacji DNA,namnaza się region β-globiny wykorzystujac technike PCR. Namnożony DNA nanosi się na filtry polaczone ze specyficznymi oligonukleotydami komplementarnymi do bad genu.Po uwidocznieniu krazkow na blonie rtg. genotyp można odczytac bezposrednio z filtrow.-Gdy ASO komplementarna do sekwencji normalnej* homozygoty prawidlowe =ciemny prazek, *heterozygoty majace 1 kopie prawidlowego genu+jasny prazek, *homozygoty sierpowatokrwinkowe nie wiaza sondy i krazek nie jest widoczny. Gdy uzyjemy sondy dla allela zmutowanego=wyniki odwrotne.

SEKWENCJONOWANIE DNA

Met. polega na ustaleniu rodzaju i kolejnosci nukleotydow w DNA, przeprowadza się przy uzyciu specjalnych aparatow.

METODA MAXAMA i GILBERTA:wykorzystuje 4 r-cje chem. Przeprowadzane w odrebnych mieszaninach , czast. DNA przecinana jest w ms-cu wystapienia tyminy, adeniny, guaniny lub cytozyny. Produkty r-cji różniące się długością są rozdzielane elektroforetycznie na żelu.

METODA SANGERA:enzymatyczne wydluzanie łańcuchów polideoksyrybonukleotydowych syntetyzowanych in vitro na 1-niciowej matrycy sekwencjowanego DNA od wyznakowanego radioizotopowego startera.R-cje przeprowadza się w 4 odrebnych mieszaninach zaw. Substraty: dCTP, dATP, dTTP, dGTP. Zakonczenie r-cji po dodaniu pochodnej dideoksyrybonukleotydow.Dideoksy-NTP terminuja wydluzanie DNA w ms-cu swego wlaczenia. Powstaje mieszanina fragmentow DNA roznej dlugosci, które można analizowac met. elektroforezy w zelu poliakrylamidowym i autoradiograficznie.Rezultat-seria prazkow DNA w zelu, z których bezposrednio odczytuje się sekwencje DNA.

ZASTOSOWANIE:analiza sekwencji produktow r-cji PCR.

ZALETY I OGRANICZENIA: sekwencjonowanie DNA pozwala na bezposrednia ocene czy sekwencja genu pacjenta rozni się w jakikolwiek sposób od prawidlowej sekwencji tego genu. Ze wzgledow technologicznych zastosowanie ogranicza się do bad. naukowych.

PCR-REAKCJA ŁAŃCUCHOWA POLIMERAZY (Polymerase Chain Reaction)=namnazanie sekwencji DNA

Pozwala na szybkie i selektywne zwielokrotnienie wybranej sekwencji DNA lub RNA.

METODA: oparta na enzematycznym zwielokrotnieniu fragm. DNA ograniczonego 2 oligonukleotydowymi starterami komplementarnymi do przeciwległych nici DNA bad. sekwencji. R-cje przeprowadza się w bloku grzejnym kontrolowanym przez mikroprocesor, produkt PCR ocenia się za pomoca elektroforezy w agarozie i barwienia bromkiem etydyny. R-cja przebiega w 3 etapach:

1.denaturacja 2-niciowego DNA (90-95˚C)=0,5-2min

2.wiazanie starterow(50-65˚C) ok. 20 nukleotydowe=30-60s

3. wydłużanie starterów-synteza powielonego fragm.DNA(68-72˚C)

Każdy cykl trwa ok. 3 min., powstałe amplikony sluza jako matryce w nastepnych cyklach r-cji prowadzac do logartymicznego przyrostu ilosci produktow.Pod koniec 1-go etapu otrzymujemy 2 kopie DNA zaw. Region który chcielismy zwielokroynic. Proces powtarza się , mieszanine podgrzewa się co uniemozliwia rozplecienie nici i ochladza się aby przyłączyły się startery. Polimeraza DNA wydłuża związane startery konczac 2 cykl. Przeprowadza się 20-40 cykli.

ZASTOSOWANIE: to met. czuła, swoista i szybka! Wykorzystywana do:

• oznaczania markerów w bad.sprzezen,

• diagnostyka chorob zakaznych i pasozytniczych( szybkiego wykrywania prątkow atypowych)

• w ustaleniu nosicielstwa zmutowanego genu w rodzinach z ryzykiem wystapienia czestych chor. genetycznych(mukowiscydoza , fenyloketonuria, dystrofia miesniowa, hemofilia, anemia sierpowata)

• w bad. nad rakiem

• w antropologii

• do namnazania DNA pobranego z pojedynczych komorek embrionu w diagnostyce preimplantacyjnej ,prenatalnej,ustalaniu ojcostwa.

ZALETY:PCR wymaga b. niewielkich ilosci DNA (ponizej 1µg lub pojedynczej komorki) wyniki w ciagu 1 dnia=wykorzystanie w kryminalistyce.

OGRANICZENIA: znajomosc sekwencji amplifikowanego fragm DNA niezbedna do syntezy swoistych starterow oligonukleotydowych uzywanych w PCR

MIESZANINA REAKCYJNA PCR:

-matryca DNA lub cDNA ( RNA przeniesione na cDNA)

-2 startery

-dNTP = mieszanina dATP, dCTP, dGTP, dTTP

-Mg²⁺

-bufor

-termostabilna polimeraza DNA (np. polimeraza Taq)

PCR multipleks

W mieszaninie reakcyjnej kilka par starterow dla roznych genow lub par starterow dla odmiennych fragm.tego samego genu.

PCR-RT-PCR( r-cja odwrotnej transkryptazy PCR)

PCR poprzedzony przepisaniem sekwencji mRNA na cDNA w r-cji odwrotnej transkrypcji w obecnosci startera (uniwersalnego oligo dT lub oligonulkeotydu swoistego dla mRNA)

Produkty r-cji PCR analizowane pod katem wyst. mutacji.Mutacje wykrywa się met.bezposrednia(sekwencjonowanie DNA), met. posrednie(SSCP, RFLP).

SSCP=polimorfizm konformacji 1-niciowego DNA

Wykorzystuje się wlasciwosc kw. nuklein. do tworzenia przez pojedyncze nici DNA tzw. konformerow , których ksztalt zal. jest od sekwencji DNA. Zmiany struktury DNA(mutacje punktowe) zmieniaja konformacje pojedynczej nici DNA-wykrywane elektroforeza w zelu poliakrylamidowym.

RFLP-polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

To polimorfizm fragmentów DNA powstajacych w nastepstwie dzialania endonukleaz retsrykcyjnych na nic DNA. Polimorfizm może być efektem tranzycji, transwersji, delecji lub insercji. Co prowadzi do powstania lub zaniku miejsca rozpoznawanego przez enzymy restrykcyjne.Mutacje zachodzace w obrebie miejsc restrykcyjnych zmieniaja dlugosc fragm. restrykcyjnych. Analiza RFLP umozliwia mapowanie genow, wykrywanie i identyfikowanie genow zwiazanych z malo poznanymi chorobami dziedzicznymi.(dzieki analizie RFLP udalo się ustalic na chromosomie X polozenie genu odpowiedzialnego za dystrofie miesni Duchenne`a.

→FINGERPRINT

Polimorfizm DNA dotyczy tez sekwencji mikro i minisatelitarnych.Mikrosatelity=krótkie tandemowe powtorzenia =STRP. Minisatelity=VNTR=zmienna liczba tandemowych powtorzen. Zmiwnnosc sekwencji VNTR polega na roznej liczbie powtorzen danego motywu w okreslonym locus. Analiza kilku loci u jednego osobnika daje charakterystyczny dla niego wzor fragmentow DNA (profil DNA)=genetyczny odcisk palca=fingerprint!Obraz jest charakterystyczny i unikatowy.Im osoby sa blizej spokrewnione tym profil DNA jest bardziej podobny. Badania „odcisków DNA” obejmuja analize markerow minisatelitarnych.Markery sa identyfikowane bo zawieraja (one lub ich poblize) miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne. Bada się zmienna liczbe okreslonych kopii i nieznaczne roznice w sekwencji nukleotydow. Sekwencje VNTR wykrywane met. Southerna po namnozeniu met.PCR. Ich analiza wykorzystywana w med. Sadowej(bad. identyfikacyjne), ustalanie stopnia pokrewienstwa(ustalanie ojcostwa)

krew→ DNA→ trawienie restryktaza

↓ ↓

PCR

↓

Elektroforeza ← hybrydyzacja SLP lub MLP

MLP-sonda multilocusowa(klasyczny fingerprint) ,bad. jednoczesnie ok. 80 alleli

SLP-sonda 1-locusowa

ANALIZA: zdjecie z kliszy Rtg, izotopowe znakowanie sondy.

Każdy prazek u dziecka musi pochodzic od matki lub ojca , jeżeli jest 1 prazek którego nie można przypasowac to mutacja .Jeżeli sa 2 lub wiecej prazkow innych niż matki i ojca to wykluczenie ojcostwa!

METODA SOUTHERNA (Southern blotting)

Polega na elektroforezie zelowej DNA i wykorzystaniu swoistych sond molekularnych.

-DNA zwykle uzyskiwany z leukocytow krwi obwodowej. Ok. 5-10μg DNA poddane dzial. enz. restrykcyjnego. Miejsca ciecia przez enzym sa swoiste dla sekwencji DNA. Powstale fragm. DNA sa rozdzielane elektroforetycznie.

-DNA poddawany denaturacji aby rozdzielic nici i przenoszony na filtr nitrocelulozowy.

-znakowana sonda przenoszona na filtr swoiscie wiaze się z komplementarna sekwencja DNA na filtrze= umozliwione wykrycie poszukiwanego fragm. DNA

ZASTOSOWANIE: W diagnostyce DNA , wykorzystuje swoiste wiazanie się sekwencji DNA uzytej jako sondy z komplementarna sekwencja wyst. w DNA ludzkim pocietym enz. restrykcyjnymi. Wykrywanie chorob genetycznych(DMD, BMD, hipercholesterolemia rodzinna).Wykrywa mutacje p odcinkowe( delecja=zmniejszenie rozmiarow lub brak prazkow, amplifikacja=prazki o zmniejszonych rozmiarach)

OGRANICZENIA: Potrzeba duzo DNA, pracochlonna(wynik po 7-14 dniach), ekspozycja na znaczniki radioaktywne

Na filtrze celulozowym; na wanience ukladamy bibule; żel z elektroforezy, filtr nitrocelulozowy. Na zasadzie saczenia molekularnego DNA z zelu przechodzi na filtr.DNA unieruchomiony na filtrze. Filtr do probowki+ sonda molekularna(wyznakowana) i do pieca hybrydyzacyjnego. Po hybrydyzacji odplukujemy nie zwiazana sonde. SACZENIE ZELU to suszenie żelu agarozowego z elektroforezy, odsaczamy z niego wode.Otrzymany plaster plastyczny i można wlozyc go do probowki + sonda i hybrydyzacja w piecu.

NORTHERN BLOTTING

Dot. RNA,wiec na etapie trawienia restryktaza, RNA krotkie wiec nie musi być czeste(?). zele denaturujace.

Elektroforeza fragm. RNA→transfer na filtr nylonowy→wiazanie RNA z filtrem(ogrzewanie 80˚C lub naswietlanie UV)→prehybrydyzacja i hybrydyzacja.

WESTERN BLOTTING -bada hybrydy DNA/RNA lub czast. Bialka przez badanie r-cji wiazania znakowanych przeciwcial przeciwko poszukiwanym gr. antygenowym.

TECHNIKA FISH( fluorescencyjna hybrydyzacja in situ)

-cytogenetyka i gen. Molekularna,

-duza rozdzielczosc

-umozliwia bad. chromosomow w roznych fazach

fragm. DNA znakowany i doprowadzany do formy 1- niciowej przez ogrzanie i gwaltowne ochlodzenie.→nakladany na wysuszone powietrzem, zdenaturowane preparaty chromosomow→przylaczona do odpowiadajacych jej w chromosomie sekwencji sonda molekularna widoczna w mikroskopie.

Metoda mapowania sklonowanych sekwencji DNA stos. Standartowo, wynik 1-2 dni!

Znakowanie nieizotpopwe oparte na wbudowywaniu biotyny do sondy DNA. Ms-ce hybrydyzacji wykrywane przy uzyciu antybiotyny (streptawidyny) sprzezonej z barwnikiem fluorescencyjnym. Kompleks analizowany w mikroskopie fluorescencyjnym Zhybrydyzowane sekwencje musza być odlegle od siebie o min. 1 Mb.(chromosomy metafazowe) wieksza rozdzielczosc metody przy uzyciu mniej skondensowanych chromosomow w jadrach interfazowych(tu możliwe rozroznienie sygnalow odleglych o 50-100 kb),jeszcze wieksza rozdzielczosc w met. gdzie wlokna chromatynowe uwalniane sz ze szkieletu bialkowego(fiberFISH)tu możliwe rozroznienie sekwencji odleglych o mniej niż 10 kb.

Preparat cytologiczny sonda molekularna

↓ ↓

Denaturacja denaturacja i znakowanie sondy

Hybrydyzacja in situ

Posrednia detekcja sondy Bezposrednia detekcja sondy

MIEDZYGATUNKOWA HYBRYDYZACJA KOMOREK SOMATYCZNYCH

Hybrydy kom. somatycznych otrzymane z fuzji 2 kom. somatycznych z hodowli komorkowych w obecnosci zinaktywowanych wirusow. Do mapowania genow wykorzystane 2 komorki( od czlowieka i 2-ga od innega gat. np. myszy). Poczatkowo hybryda ma po2 zestaw chromosomow potem wybiorcza utrata ch. ludzkich (losowo). Ch. mysie odroznia się na podstawie morfologii i przez barwienie odcz. Giemsy w zasad. PH(sa purpurowe a ludzkie niebieskie).

Gdy np. w hybrydzie mysia linia rodzicielska jest homozygotyczna dla niedoboru kinazy tymidynowej-obecnosc enzymu=ze w kom. obecny jest chromosom czlowieka wytwarzajacy ten gen.

ANALIZA DOT-BLOT CHROMOOMÓW Z FLUORYMETRU PRZEPŁYWOWEGO

Za pomoca FACS (aktywny fluorescencyjnie sorter komorkowy) można :

-ulozyc chromosomy metafazowe w kariotyp cytomeryczny

-rozdzlelic specyficzne chromosomy lub ich grupy do probowek

Wysortowane chromosomy wykorzystuje się do sporzadzania specyficznych bibliotek DNA lub do mapowania genow.

Mapowanie sekw. DNA za pomoca FACS =wysortowanie 10 000 chromos. Kazdej pary na filtr nitrocelulozowy→denaturowanie chromosomow i okreslona wyznakowana radioizotopem sonda hybrydyzowana jest do pelnego zestawu filtrow.Przypisanie sondy do okreslonego chromosomu-autoradiograficznie.. Region lokalizacji wyznaczony przy wykorzystaniu „dot-blots” dla wysortowanych translokacji chromosomowych.

---