BUDOWA DNA i RNA DNA: polimer dwuniciowy podstawą budowy jest nukleotyd zbudowany z reszty kwasu fosforowego, cukru z grupy pentoz 2-deoksyrybozy i jednej z 4 zasad azotowych: tyminy (T), cytozyny (C), adeniny (A) i guaniny (G). RNA: jednoniciowynukleotyd jest zbudowany z reszty kwasu fosforowego, cukru rybozy i zasad: adeniny, cytozyny, guaniny i uracylu. Wyróznia się kilka rodzajów RNA: snRNA, hnRNA, mRNA, tRNA, rRNAPOZIOMY UPAKOWANIA DNA w chromosomach Upakowanie dna rozpatruje się w kilku poziomach: 1. Nukleosomy(nukleonom to jednostka w ktorej skład wchodzą: białkowy rdzeń, nic dna oplatająca dyskowaty oktamer, białko spinające nic dna od strony zewnętrznej)2.soleniody(łancuchy chromosomów zorganizowane są w struktury przypominające sprężynę w której zwoje to koralikowate łańcuchy nukleosomów).REPLIKACJA-endoenergetyczny proces, w którym podwójna nić DNA (podwójna helisa) ulega skopiowaniu. Replikacja jest semikonserwatywna (półzachowawcza) - w każdej z dwóch uzyskanych podwójnych nici DNA będzie jedna nić macierzysta i jedna nowa. Proces ten zachodzi podczas interfazy, Polimeraza DNA działa jedynie w kierunku od końca 3' do końca 5' (czyli syntetyzuje nową nić w kierunku od 5' do 3'). Z tego powodu jedna z nici jest syntezowana w sposób ciągły. Substratami tego procesu są: matryca DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów (dNTP), ATP - energia dla helikaz.
TRANSKRYPCJA-proces syntezy RNA na matrycy DNA przez różne polimerazy RNA, czyli przepisywanie informacji zawartej w DNA na RNA. Matryca jest odczytywana w kierunku 3' → 5', a nowa cząsteczka RNA powstaje w kierunku 5' → 3'. Podczas transkrypcji polimeraza RNA buduje cząsteczkę RNA łącząc zgodnie z zasadą komplementarności pojedyncze rybonukleotydy według kodu matrycowej nici DNA.
translacja polega na przetłumaczeniu informacji genetycznej zawartej w sekwencji nukleotydów w mRNA na sekwencję aminokwasów w syntetyzowanym białku. Proces translacji poprzedza aktywacja aminokwasu kosztem energii pochodzącej z ATP przy udziale enzymu, który rozpoznaje i przyłącza odpowiedni aminokwas do właściwego tRNA. Proces ten nosi nazwę aminoacylacji, natomiast tRNA z przyłączonym aminokwasem określany jest jako aminoacylo-tRNA. LABORATORIUM Wyposażenie, wielkość i organizacja laboratorium kultur in vitro, są uzależnione od celów jakie chcemy osiągnąć oraz skali prac. Laboratorium może być prowadzone w celach: -Badawczych, -Dydaktycznych, -Związanych z hodowlą twórczą roślin-Związanych z hodowlą zachowawczą i ochroną zasobów genowych -W celach produkcyjnych (np. reprodukcja sadzonek na skalę komercyjną)
Minimalne wymagania lokalowe dla laboratorium in vitro, to dwa pomieszczenia:1.Niesterylne (dla roślin świeżo zebranych, kultur zakażonych, szkła laboratoryjnego przeznaczonego do mycia itp.)
2.Sterylne (dla pożywek, pobranych fragmentów tkanek roślinnych itp.)Wszystkie pomieszczenia muszą być utrzymywane w czystości, gdyż kultury in vitrosą bardzo podatne na zakażenia.
Ze względu na zróżnicowane wymagania co do warunków wzrostu różnych kultur wskazane jest wyposażenie pomieszczenia wzrostowego w klimatyzator, regulację natężenia oświetlenia i zegar sterujący zmianami warunków. Materiał roślinny do kultur in vitro:Do kultur in vitro-może być pobierany z pola, szklarni, fitotronów (pomieszczeń lub szaf, w których można precyzyjnie programować w czasie: temperaturę, oświetlenie i wilgotność). Rośliny muszą być utrzymane w pełnej zdrowotności, pozbawione części zaschniętych, bez zanieczyszczeń. Przed pobraniem eksplantantów rośliny wyjaławia się (alkohol, podchloryn sodu itp.) Z kultur in vitro-rośliny wymagają aklimatyzacji (rosły na sterylnej pożywce w warunkach wysokiej wilgotności) -początkowo przenosi się je do sterylnego podłoża (gleby, piasku) i stosuje zamgławianie przez 1-2 tyg., a dopiero potem przenosi do miejsca ich docelowej wegetacji.Rodzaje kultur in vitro Kultury kalusa: Kalus (tkanka przyranna) -niezróżnicowana, dzieląca się tkanka roślinna tworząca się na obrzeżu zranienia z komórek, które ulegają odróżnicowaniu. W kulturze invitro można zainicjować tworzenie kalusa przez dowolny organ lub tkankę, ale efektywność tych działań jest różna. U każdego gatunku można znaleźć organy i tkanki, z których stosunkowo łatwo otrzymać kalus. Rośliny dwuliścienne są ogólnie bardziej skłonne do tworzenia kalusa niż jednoliścienne. W obrębie tkanki kalusowej po pewnym czasie dochodzi do częściowego różnicowania -na peryferiach tworzą się centra merystematyczne, wewnątrz nieregularne (i niefunkcjonalne) formacje tkanek przewodzących i parenchymatycznych.Kultura zawiesin komórkowych: Powstaje najczęściej z luźnej i mało zróżnicowanej tkanki kalusowej. Zawiesiny składają się z pojedynczych komórek oraz agregatów (skupisk). Kultury zawiesin mogą być prowadzone w systemie okresowym (wymagającym okresowego pasażowania co 8-21 dni) lub ciągłym (w urządzeniach o charakterze bioreaktorów zapewniających regulację gęstości komórek oraz systematyczną wymianę składników pożywki)Kultury organów roślinnych:-Kultury odciętych korzeni-Kultury wierzchołków i pąków bocznych pędu. Wykorzystuje się tu zdolność ekplantantu do tworzenia organów przybyszowych, a szczególnie możliwość regeneracji z pierwotnej tkanki merystematycznej wniesionej z ekplantantem. Powstawanie organów z merystemów pierwotnych, z pominięciem kalusa, charakteryzuje się większą stabilnością genetyczną i jest wykorzystywane w mikrorozmnażaniui uwalnianiu tkanek od wirusów. Zauważone też, że obecność niektórych organów (np. korzeni) przyspiesza syntezę niektórych produktów (metabolitów) wykorzystywanych w przemyśle farmaceutycznym.
Metody eliminowania wirusów:1.Zwalczanie wektorów wirusów (klasyczna)2.Chemoterapia in vitro(np. rybawiryna -przeciwdziała replikacji i degraduje wirusy nie działając fitotoksycznie na tkanki roślin; cytokininy)3.Termoterapia in vivo izolowanie wierzchołków pędów z roślin po termoterapii (podwyższona temperatura do ok. 36C prowadzi do eliminacji wirusów, szczególnie w merystemach)4.Termoterapia in vitro(podwyższona temp. ok 36C w kulturach merystemów lub kalusa)5.Krioterapia (zamrożenie tkanki w ciekłym azocie do minus 196C)6.Kultura in vitro izolowanych merystemów (sama w sobie nie zawsze skuteczna) fuzja protoplastów:Izolacja protoplastów polega na enzymatycznym usunięciu ściany komórkowej roślin w sposób pozwalający na pozostawienie całej żywej zawartości komórki otoczonej błoną komórkową. Źródłem komórek mogą być różne tkanki, ale do celów związanych z późniejszą regeneracją roślin wybierane są głównie tkanki w wysokim stopniu totipotentne. Materiał wyjściowy do pozyskiwania protoplastów musi byc całkowicie aseptyczny -sterylizowanie materiału pobranego z pola lub szklarni jest teoretycznie możliwe, ale przeważnie niewystarczająco skuteczne. Na ogół materiał wyjściowy do kultur protoplastów stanowią komórki pochodzące z kultur in vitro np. kultury zawiesinowe, kultury organów itp. Roztwór stosowany do izolowania protoplastów zawiera enzymy (z grupy celulaz i pektynaz), regulator ciśnienia osmotycznego i sole mineralne (czasami też witaminy i substancje wzrostowe). Szczegółowy dobór enzymów jest uzależniony składem chemicznym ściany komórkowej, a to zależy od gatunku rośliny i rodzaju komórek (tkanek). Po trawieniu ścian oddziela się żywe protoplasty od nierozłożonych tkanek i martwych komórek (filtrowania, wirowania, zawiesiny w odpowiednio dobranych roztworach).Jedną z głównych zalet kultur protoplastów jest możliwość ich łączenia (niezależnie od pochodzenia komórek). Do protoplastów można też wprowadzać każdą strukturę komórkową (w tym jądro, plastydy, mitochondria -oragnelle wnoszące określony materiał genetyczny). Nowe kombinacje genomów cytoplazmatycznych i jądrowych można otrzymać poprzez fuzję subprotoplastów:
-cytoplastów (zawierają cytoplazmę z mitochondriami i plastydami, ale pozbawione są jąder)-karioplastów (zawierają jądra z minimalną liczbą organelli lub bez organelli, jeśli to możliwe)W wyniku łączenia protoplastów uzyskuje się mieszańce somatyczne.
Mieszańce somatyczne to komórki i zregenerowane z nich rośliny otrzymane w wyniku fuzji protoplastów komórek somatycznych.Ich tworzenie z wykorzystaniem kultur in vitroprowadzi do powstawania nowych kombinacji jądrowych, jądrowo-cytoplazmatycznych i cytoplazmatycznych (często niemożliwych do uzyskania metodami tradycyjnymi ze względu na bariery krzyżowalności).Etapy powstawania mieszańców somatycznych:1.Izolacja i zmieszanie ze sobą protoplastów dwóch komponentów przeznaczonych do fuzji (protoplasty te powinny mieć podobną wielkość i być całkowicie pozbawione ścian komórkowych)2.Użycie czynników stymulujących fuzję (sprzyjających kontaktowi błon komórkowych, ich częściowej degradacji i następnie odbudowaniu -połączenie błon komórkowych w jedną wspólną otoczkę)3.Identyfikacja i selekcja komórek mieszańcowych4.Kultura komórek mieszańcowych i regeneracja roślin5.Potwierdzenie mieszańcowego charakteru uzyskanych roślin.
Zastosowania kultur in vitro:1.Rozmnażanie wegetatywne cennych materiałów (mikrorozmnażanie):Pozwala uzyskiwać potomstwo form o niepowtarzalnych cechach, które nie mogłyby zostać zachowane przy rozmnażaniu generatywnym (zostałyby utracone na skutek rekombinacji genetycznej) Stosowane np. w hodowli roślin ozdobnych2. Otrzymywanie roślin wolnych od patogenów Pozwala na otrzymanie roślin wolnych od wirusów. Rośliny uzyskuje się przez mikrorozmnażanie z bardzo małych stożków wzrostu lub stożków wzrostu roślin poddanych działaniu wysokiej temperatury, krioterapii, chemioterapii.3. Selekcja w kulturach in vitro-możliwa do przeprowadzenia pod warunkiem istnienia korelacji między reakcją komórek lub tkanek roślinnych w kulturze in vitro, a reakcją otrzymanej z niej rośliny w warunkach uprawy (w polu lub szklarni) Zastosowanie -np. w hodowli odpornościowej przy zastosowaniu metabolitów patogena (toksyn) jako czynnika selekcyjnego Zalety: Możliwość oceny dużej liczby genotypów na małej powierzchni, Uniezależnienie od pory roku i warunków środowiska 4. Wykorzystanie zmienności somaklonalnej:Zmienność pojawiająca się w kulturach kallusowych może być dziedziczna. Zasada wykorzystania zmienności somaklonalnej jest identyczna z indukowaną mutaganezą, brak pozytywnych przykładów jej wykorzystania w praktycznej hodowli 5. Kultury zarodków F1 mieszańców oddalonych: Zarodek mieszańcowy w odpowiednim stadium rozwoju przenoszony jest na pożywkę pozwalającą na jego dalszy rozwój. Poprawia skuteczność krzyżowań oddalonych, gdy występuje niezgodność między zarodkiem i bielmem rośliny matecznej lub niedorozwój bielma (przy nieprawidłowym zapłodnieniu komórki centralnej)6. Kultury protoplastów Dzielące się w kulturze protoplasty mogą ulegać fuzji (łączyć się) nawet jeśli są to komórki różne gatunkowo. Kultury protoplastów wykorzystywane są do tworzenia mieszańców oddalonych, u których bariera krzyżowalności jest trudna (lub niemożliwa) do pokonania poprzez tradycyjne krzyżowania międzygatunkowe. Zastosowania: przenoszenie genów odporności np. u ziemniaka (Ervinia carotovora, nicienie), u rzepaku (kiła), uzyskiwanie form cms u rzepaku, kapusty 7. Otrzymywanie podwojonych haploidów Prace prowadzone od 1964 roku. Rośliny haploidalne uzyskano dla ponad 200 gatunków roślinUzyskiwanie form homozygotycznych (linii DH -genetycznych odpowiedników linii czystych):a.Krzyżowania międzygatunkowe: metoda bulbosowa u jęczmienia (1970), metoda kukurydziana u pszenicy i pszenżyta b.Kultury pylników lub mikrospor (androgeneza) c.Kultury niezapłodnionych zalążków (gynogeneza)8. Kolekcjonowanie materiałów genetycznych (banki genów, np. dla winorośli) -ochrona zasobów genowychGMO -Genetically Modified Organisms -Organizmy Modyfikowane Genetycznie czyli organizmy transgeniczne: rośliny, zwierzęta, mikroorganizmy, które zawierają w swych organizmach włączony do genomu gen z obcego gatunku, które zostały otrzymane przez wprowadzenie tego genu metodami inżynierii genetycznej.
Etapy tworzenia roślin GMO:1. wyizolowanie genu - etap niezbędny do otrzymania organizmów transgenicznych realizowany w ramach działań z zakresu genetyki molekularnej. Otrzymane geny mogą być następnie szczegółowo analizowane (pod względem budowy i funkcjonowania), a wiedza ta może być wykorzystana w praktyce (hodowla, przemysł chemiczny, farmaceutyczny itd.) lub też można je wykorzystać do tworzenia nowych konstrukcji genowych. Podstawą do izolacji genu jest wiedza o nim, a w szczególności cztery następujące charakterystyki:-sekwencja (określona struktura pierwszorzędowa)-dokładna lokalizacja genu w genomie-rodzaj kodowanego RNA i wzór jego ekspresji-funkcja genu 2.stworzenie tzw. konstruktu zawierającego gen, promotor (przeważnie konstytutywny), wzgl. połączenie z DNA wektora Sekwencja DNA kodująca określoną cechę fenotypową będzie podlegała ekspresji (będzie dawała efekt fenotypowy), jeśli znajdzie się pod kontrolą odpowiedniego promotora. Jeżeli planujemy wprowadzić do rośliny gen pochodzący od bardzo odległych taksonomicznie organizmów (np. bakterii, grzybów), to musimy połączyć sekwencję kodującą określone białko z promotorem działającym w komórkach roślinnych. Promotory konstytutywne działają na wszystkich etapach rozwojowych rośliny, powodując że dany gen podlega ekspresji również w okresie, kiedy jego produkt nie jest potrzebny.3. transformacja (wprowadzanie DNA do genomu biorcy)4. selekcja Transformacja wektorowa:-plazmidy bakterii korzeniowych (Agrobacterium tumefaciens), które są wprowadzane do komórek roślinnych w czasie infekcji i zostają włączone do materiału genetycznego komórek gospodarza (rośliny) -metoda skuteczna głównie przy transformacji roślin dwuliściennych. Efektem wprowadzenia plazmidu do komórek korzenia jest powstawanie charakterystycznych narośli. Geny przeznaczone do transformacji wprowadza się w miejsce oryginalnych bakteryjnych genów plazmidu.-genomy wirusów -wprowadza się geny w miejsce materiału genetycznego wirusa pozostawiając tylko tę część jego materiału genetycznego (DNA lub RNA), która odpowiada za zdolność do infekowania rośliny. Zalety: duża skuteczność; Wady: mała pojemność
Transformacja bezpośrednia:-elektroporacja -wytwarzana jest seria impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony komórkowej powodując powstawanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki.-PEG (glikol polietylenowy) jest substancją chemiczną powodującą zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej (podobnie jak przy elektroporacji). Dezorganizacja błony jest odwracalna-mikroinjekcja -wymaga zastosowania mikromanipulatora, dzięki któremu możliwe jest wstrzyknięcie roztworu DNA do wnętrza jądra komórkowego.-wstrzeliwanie -DNA nanosi się na mikroskopijne (0,5-5 mikrometrów) kulki ze złota, platyny lub wolframu. Całość wstrzeliwana jest w tkankę przy użyciu „armatki genowej”. Metoda powoduje szereg uszkodzeń w tkance, ale jest prosta w zastosowaniu.-fuzja liposomów -tworzy się sztuczną podwójną błonę lipidową na roztworze z cząsteczkami DNA. Po wstrząśnięciu błona otacza cząsteczki DNA tworząc banieczki osłaniające materiał genetyczny. Liposomy łączą się z protoplastami komórek wprowadzając DNA do środka. Główne kierunki prac nad GMO:-odporność na herbicydy (gen bar -acetylotransferaza z Streptomeces hygroscopicus warunkuje odporność buraka cukr. na herbicyd Basta; geny tolerancji na Glyphosate czyli Roundup -wprowadzone do soji, kukurydzy, bawełny, rzepaku, tytoniu)-poprawa cech użytkowychnp. pomidor (Flavr Savr), melon -zmieniona charakterystyka dojrzewania; oleiste -zmiana składu kwasów tłuszczowych-odporność na szkodniki (geny bakteryjne np. Bt -Bacillus thuringensis, białko Cry -endotoksyna warunkująca odporność ziemniaka na stonkę; geny baktryjne kodujące chitynazy i glukanazy warunkujące odporność pomidora na fuzariozy)Pomidor Flar Savr pierwszy GMO wprowadzony do sprzedaży, dzięki modyfikacji zachowywał dłużej świeżość.Kukurydza Bt z genem bakteryjnym Bacillus thuringensis odporna na porażenie przez Omacnicę prasowiankę Sałata produkująca białko uodparniające na zapalenie wątroby typu B -roślina została tu potraktowana jako bioreaktor do produkcji szczepionki. Została opracowana w Polsce. W ten sposób można produkować również inne białka: enzymy, antybiotyki.„Złoty ryż” modyfikacja ryżu zawiera geny z żąkila powodujące zwiększoną akumulację w jego ziarnie beta-karotenu (pro-witaminy A).