Immunofluorescencyjna lokalizacja białka ZTL i NPH1 w liścieniach siewek Pharbitis nil.

Najważniejszym czynnikiem środowiskowym wpływającym na funkcjonowanie zegara okołodobowego u roślin jest światło. Zegar biologiczny składa się z trzech elementów: drogi wejścia (ang. input), wewnętrznego oscylatora oraz drogi wyjścia (ang. output) (Hayama i Coupland 2004, Salome i McClung 2004). Droga wejścia jest układem związanym z percepcją sygnałów środowiskowych i ich przekazywaniem do wewnętrznego oscylatora. Centralny oscylator działa na zasadzie pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego generując rytmy biologiczne. Droga wyjścia to układ związany z przekazywaniem wygenerowanego rytmu do systemów wykonawczych, kontrolujących rytmiczność określonego procesu (np. ruchy aparatów szparkowych, fotosynteza itp.) (Zienkiewicz i in. 2004).

Pierwszym etapem transdukcji sygnału świetlnego do wewnętrznego oscylatora zegara jest jego percepcja przez wyspecjalizowane cząsteczki chromoprotein pełniące funkcje fotoreceptorów, do których zaliczamy:

• receptory światła czerwonego i dalekiej czerwieni - fitochromy

• receptory światła niebieskiego - kryptochromy

• flawoproteiny z rodziny ZEITLUPE (ZTL/FKF1/LKP2)

• receptory światła niebieskiego - fototropiny

Fototropiny (NPH1 - NON PHOTOTROPIC HYPOCOTYL/PHOT1) są kinazami białkowymi aktywowanymi przez światło niebieskie. Białka te zawierają w regionie N-końcowym fragmenty tworzące dwie domeny LOV (ang. LIGHT, OXYGEN, VOLTAGE), należące do klasy domen motywu PAS, odpowiedzialne za interakcje białko - białko. Natomiast w części C- końcowej występuje jedenaście charakterystycznych poddomen obecnych w serynowowo/treoninowych kinazach. Domena LOV występująca w NPH1 wiąże grupę chromoforowi (FMN), która odpowiada za absorbcję światła niebieskiego (Kopcewicz i Lewak, 2002). Jak dotąd wykazano, iż fototropina pośredniczy w reakcjach fototropicznych, migracji chloroplastów oraz otwieraniu aparatów szparkowych (Huala i in., 1997, Briggs i in., 2000, Sullivan i Deng, 2003)

Przygotowanie materiałów i odczynników

1. Utrwalanie materiału

• Organy siewek Pharbitis nil cięto skalpelem na małe fragmenty, a następnie umieszczano w utrwalaczu na okres od 6 do 12 godzin w temp. 4^oC. Do utrwalania materiału roślinnego zastosowano roztwór 4% formaldehydu z 0,25% aldehydem glutarowym w buforze 1 x PBS.

Przygotowanie utrwalacza chemicznego: do 20 ml H₂O dodawano 2g paraformaldehydu, który rozpuszczano na mieszadle magnetycznym mierząc jednocześnie temperaturę roztworu. Gdy temperatura wzrosła do 55^o C dodawano niewielką ilość 1 M NaOH w wyniku czego roztwór stał się klarowny. Następnie roztwór chłodzono i dodawano 0,5 ml aldehydu glutarowego oraz 25 ml buforu 1 x PBS. Powstałą mieszaninę przesączano z wykorzystaniem karbowanego sączka. Po przesączaniu ustalano pH do 7.2 i uzupełniano wodą do 50 ml.

2. Zatapianie materiału w żywicy BMM

• Utrwalony materiał odpłukiwano w trzech zmianach 1 x PBS, każda po 10 minut, następnie materiał odwadniano w serii etanolu z dodatkiem DTT w stężeniu 0,015g na 1 ml etanolu.

• Po odwodnieniu materiał przesycano żywicą BMM, którą przygotowywano w następujący sposób. Do 20 ml metakrylanu butylu dodawano 5 ml metakrylanu metylu, 125 mg 2-Ethoxy-2-phenylacetophenon oraz 0,0385g DTT. Mieszaninę przesycano następnie azotem gazowym przez ok.15 min. Następnie z żywicą szczelnie zamykano i przechowywano w temp. 4^o C.

• Przesycanie materiału żywicą BMM przebiegało kilkuetapowo poprzez umieszczanie materiału w każdym z przygotowanych roztworów na 24 godziny w 4^oC:

- 25% roztwór BMM w alkoholu bezwodnym 99,8%,

- 50% roztwór BMM w alkoholu bezwodnym 99,8%,

- 75% roztwór BMM w alkoholu bezwodnym 99,8%,

- 100% roztwór BMM.

Przesycony żywicą materiał przenoszono do UV - odpornych kapsułek typu BEEM

firmy Polyscience i zatapiano w 100% żywicy BMM. Polimeryzację żywicy prowadzono w świetle UV w temp. -20^oC przez 48h.

3. Przygotowanie półcienkich skrawków

Utrwalony i zatopiony w żywicy BMM materiał krojono na półcienkie skrawki (1500 nm) przy użyciu ultramikrotomu Leica UTC. Skrawki umieszczano na pokrytych silanem szkiełkach podstawowych.

4. Materiały do ćwiczeń

• Kuwetki szklane, szkiełka podstawowe i nakrywkowe, wilgotna komora,

• 100% aceton

• Bufor 1 x PBS pH 7,2 ( na 1000 ml: 8g NaCl; 0,2g KCl, 1,44g Na₂HPO₄; 0,24g KH₂PO₄)

• Woda bidestylowana

• Roztwory przeciwciał:

- pierwotne przeciwciało królicze anty-NPH1 (stężenie 1:250, 1 μl przeciwciała na 250 μl 1% BSA w 1 x PBS),

- wtórne przeciwciało anty-króliczym IgG znakowane fluorochromem Alexa Fluor 488 ( stężenie 1:500, 1 μl przeciwciała na 500 μl 1% BSA w 1 x PBS),

• DAPI,

• Antyfadant CitiFluor

Immunofluorescencyjna lokalizacja białka fototropiny NPH1

Dzień I.

1. Odpłukiwanie żywicy BMM

Przygotować 5 szklanych kuwetek. Do dwóch nalać 100% aceton, do jednej wody bidestylowanej i do dwóch buforu PBS.

• Szkiełko podstawowe z materiałem roślinnym umieścić w kuwetce wypełnionej 100% acetonem na okres 10 min.

• Przenieść (przy pomocy pęset) szkiełko podstawowe do drugiej kuwetki z acetonem na 10 min.

• Przenieść szkiełko podstawowe do kuwetki z wodą bidestylowaną na 5 min.

• Wylać wodę, nalać świeżej wody bidestylowanej i inkubować przez 5 min.

• Przenieść szkiełko podstawowe do kuwetki z 1 x PBS na 5 min.

• Przenieść szkiełko podstawowe do drugiej kuwetki z buforem 1 x PBS na okres 5 min.

2. Inkubacja z przeciwciałami pierwotnymi

• Szkiełko podstawowe z materiałem roślinnym położyć na brzegu szklanej kuwetki (sprawdzić czy materiał roślinny jest na górze!!!), do kuwetki nalać niewielką ilość wody bidestylowanej, w celu zwiększenia wilgotności powietrza.

• Nałożyć na szkiełko 30 μl (na materiał roślinny) roztworu pierwotnego przeciwciała króliczego anty-NPH1. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym.

• Szkiełko podstawowe z kuwetką umieścić w wilgotnej komorze (pudełko plastikowe wyłożone ręcznikiem papierowym zwilżonym wodą), szczelnie zamknąć i pozostawić na noc w temperaturze 4^oC.

Dzień II.

1. Odpłukiwanie przeciwciał pierwotnych

• Wyciągnąć kuwetkę ze szkiełkiem podstawowym z wilgotnej komory,

• Na szkiełko nałożyć 1 ml buforu 1 x PBS, gdy szkiełko nakrywkowe podniesie się zrzucić energicznym ruchem szkiełko nakrywkowe ze szkiełka podstawowego,

• Umieścić szkiełko podstawowe ponownie na brzegu kuwetki (materiałem roślinnym do góry!!!)

• Nałożyć na szkiełko 1 ml buforu 1 x PBS i inkubować 10 min.

• Odsączyć bufor ze szkiełka (poprzez przyłożenie szkiełka dłuższym bokiem pod kątem prostym do bibuły), następnie umieścić szkiełko podstawowe ponownie na kuwetce.

• Nałożyć na szkiełko 1 ml buforu 1 x PBS i inkubować 10 min.

• Odsączyć bufor ze szkiełka i nałożyć 1 ml buforu 1 x PBS - inkubować 10 min.

2. Inkubacja z przeciwciałami wtórnymi

• Odsączyć bufor 1 x PBS, szkiełko podstawowe z materiałem roślinnym położyć na szklanej kuwetce (sprawdzić czy materiał roślinny jest na górze!!!), do kuwetki nalać niewielką ilość wody bidestylowanej.

• Nałożyć na szkiełko 30 μl (na materiał roślinny) roztworu wtórnego przeciwciała anty-króliczego IgG znakowanego fluorochromem Alexa Fluor 488. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym.

• Szkiełko podstawowe z kuwetką umieścić w wilgotnej komorze, szczelnie zamknąć i pozostawić na 1 godz. w temp. 37^oC.

3. Odpłukiwanie przeciwciał wtórnych

• Wyciągnąć kuwetkę ze szkiełkiem podstawowym z wilgotnej komory.

• Na szkiełko nałożyć 1 ml buforu 1 x PBS, gdy szkiełko nakrywkowe podniesie się zrzucić energicznym ruchem szkiełko nakrywkowe ze szkiełka podstawowego,

• Umieścić szkiełko podstawowe ponownie na kuwetce (materiałem roślinnym do góry!!)

• Odpłukać nadmiar przeciwciała wtórnego (w ten sam sposób jak w punkcie 1) poprzez inkubację 3 x 10 min. w buforze 1 x PBS.

• Następnie 3 x 5 min. wodą bidestylowaną.

4. Wizualizacja DNA

• Odsączyć wodę bidestylowaną, szkiełko podstawowe z materiałem roślinnym położyć na szklanej kuwetce (sprawdzić czy materiał jest na górze!!!),

• Na szkiełko podstawowe nałożyć 30 μl barwnika DAPI i inkubować przez 10 min

• Odpłukać DAPI przez nałożenie na szkiełko na 5 min 1 ml buforu 1 x PBS.

5. Nałożenie roztworu przedłużającego efekt fluorescencji (antyfadant)

• Odsączyć bufor 1 x PBS bardzo dokładnie za pomocą bibuły, szkiełko podstawowe z materiałem roślinnym położyć na szklanej kuwetce (sprawdzić czy materiał roślinny jest na górze!!!),

• Nałożyć 15 μl roztworu antyfadantu CitiFluor, przykryć szkiełkiem nakrywkowym.

Tak przygotowane preparaty można przechowywać w temp. - 20^oC przez okres ok. tygodnia

6. Obserwacja wyników w mikroskopie fluorescencyjnym

DAPI -świecenie niebieskie

Fluorochrom Alexa Fluor 488 - świecenie zielone

Autofluorescencja chlorofilu - świecenie czerwone