Agata Grygierczyk
numer indeksu: 173616
SPRAWOZDANIE Z ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH Z BIOCHEMII
Temat: Wpływ inhibitorów i czynników fizycznych na przebieg reakcji enzymatycznej.
Opis ćwiczenia.
Wpływ pH na aktywność inwertazy z drożdży.
Do 6 kolejnych probówek wprowadzić 1 ml buforu o pH 3; 4,7; 5; 7; 9 i 11. Nastepnie do każdej dodać 1 ml 0,3M sacharozy oraz 1 ml inwertazy o optymalnym stężeniu. Do kolejnej probówki wlać 1 ml buforu o pH 4,7, 1ml 0,3M sacharozy i 1 ml wody, będzie stanowiła próbę kontrolną. Pozostawić probówki na 30 minut. Po tym czasie zalkalizować próby paroma kroplami 1M NaOH. Następnie przeprowadzamy próbę Benedicta. Do czystych probówek dodajemy po 1 ml odczynnika Benadicta, a następnie 0,2 ml mieszaniny reakcyjnej i wstawiamy na 1-2 minuty do wrzącej łaźni wodnej.
Wpływ temperatury na aktywność inwertazy z drożdży.
Do 6 kolejnych probówek wprowadzamy po 0,5 ml sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7. Do 5 z nich dodajemy 0,5 ml inwertazy drożdżowej o optymalnym stężeniu. Do ostatniej dodajemy 0,5 ml wody, będzie stanowiła próbę kontrolną. Próby umieszczamy na 30 minut w temperaturze: 4, 20, 37, 60, 100 oC, a próbę kontrolną w temperaturze 20 oC. Po tym czasie zalkalizować próby paroma kroplami 1M NaOH. Następnie przeprowadzamy próbę Benedicta. Do czystych probówek dodajemy po 1 ml odczynnika Benadicta, a następnie 0,2 ml mieszaniny reakcyjnej i wstawiamy na 1-2 minuty do wrzącej łaźni wodnej.
Wpływ promieniowania UV na aktywność inwertazy z drożdży.
Na szkiełku zegarkowym umieszczamy 6 ml inwertazy i poddajemy ją naświetlaniu, przez czas: 0 sek., 10 sek., 20 sek., 30 sek., 1 min., 2 min.,3 min., 4 min.. Następnie w probówkach umieszczamy o,5 ml roztworu i dodajemy 0,5 ml sacharozy w buforze octanowym o pH 4,7. Pozostawić probówki na 30 minut. Po tym czasie zalkalizować próby paroma kroplami 1M NaOH. Następnie przeprowadzamy próbę Benedicta. Do czystych probówek dodajemy po 1 ml odczynnika Benadicta, a następnie 0,2 ml mieszaniny reakcyjnej i wstawiamy na 1-2 minuty do wrzącej łaźni wodnej.
Wyniki.
Wpływ pH na aktywność inwertazy z drożdży.
W próbie kontrolnej oraz w probówkach z buforem o pH 2, 9 i 11 roztwór się nie odbarwił.
W probówce z buforem o pH 7 nastąpiła lekka zmiana zabarwienia, zaś w probówkach z buforem o pH 4,7 i 5 zmiana zabarwienia była silniejsza.
Wpływ temperatury na aktywność inwertazy z drożdży.
W próbie kontrolnej oraz w probówce z temperatury 100 oC roztwór nie odbarwił się. W probówkach z temperatury 4 i 60 oC nastąpiła lekka zmiana zabarwienia, w probówce z temperatury 20 oC zmiana zabarwienia była silniejsza, zaś w probówce z temperatury 37 oC nastąpiło zabarwienie na kolor czerwony.
Wpływ promieniowania UV na aktywność inwertazy z drożdży.
W probówkach o czasie naświetlania 0sek., 10 sek., 20 sek. nastąpiło zabarwienie roztworu na czerwono. W probówce o czasie naświetlania 30 sek. nastąpiła lekka zmiana zabarwienia, zaś w probówkach o czasie naświetlania 1min., 2 min., 3 min., 4 min. roztwór nie odbarwił się.
Wnioski.
Wpływ pH na aktywność inwertazy z drożdży.
Inwertaza rozkłada sacharozę na glukozę i fruktozę, czyli cukry redukujące, dlatego wpływ jej działania można wykryć próbą Benadticta. Aktywna jest w zakresie pH od 4 do 6, jednak jej optimum przypada na pH 4,7, dlatego w probówkach z buforem o pH 4,7 i 5 powinno nastąpić zabarwienie na czerwono, jednak tak się nie stało. Wpływ na to mogło mieć niewłaściwe stężenie inwertazy, bądź w momencie alkalizacji powstało zbyt zasadowe środowisko, które spowodowało denaturację białka.
3.2. Wpływ temperatury na aktywność inwertazy z drożdży.
Inwertaza rozkłada sacharozę na glukozę i fruktozę, czyli cukry redukujące, dlatego wpływ jej działania można wykryć próbą Benadticta. Ze wzrostem temperatury zwiększa się szybkość reakcji enzymatycznej. Inwertaza aktywna jest do temperatury 65 oC, dlatego w probówkach z temperatury 4, 20, 37 oraz 60 oC powinno nastąpić zabarwienie na czerwono, jednak tak się nie stało. Wpływ na to mógł mieć fakt, że w momencie alkalizacji powstało zbyt zasadowe środowisko, które spowodowało denaturację białka.
Wpływ promieniowania UV na aktywność inwertazy z drożdży.
Inwertaza rozkłada sacharozę na glukozę i fruktozę, czyli cukry redukujące, dlatego wpływ jej działania można wykryć próbą Benadticta. Aminokwasy aromatyczne występujące w białkach absorbują promieniowanie UV, co powoduje zaburzenie ich struktury. Czas naświetlania: 0sek., 10 sek., 20 sek. jest niewystarczający, aby zaburzyć strukturę białka, dlatego sacharoza pod wpływem inwertazy uległa rozkładowi na glukozę i fruktozę, co wykazała próba Benedicta. Dłuższy czas naświetlania powoduje już zakłócenia w strukturze białka. Zaś czas naświetlania powyżej 1 minuty powoduje zniszczenie struktury białka, a tym samym niszczy enzym, dlatego nie nastąpił rozkład sacharozy do glukozy i fruktozy, co potwierdziła próba Benedicta (nie nastąpiło odbarwienie roztworu).