Natalia Maciejewska, Paulina Rusinek, Aleksandra Smędzik gr. Pon. 12.15
1. Oznaczanie aktywności katalazy (EC 1.11.1.6) i wyznaczanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznej.
Cel : Katalaza czyli oksydoreduktaza nadtlenek wodoru : nadtlenek wodoru jest to hemoproteina rozkładająca nadtlenek wodoru wg następującej reakcji :
H2O2 + H2O2 -> 2 H2O + O2↑
Celem ćwiczenia było poznanie szybkości rozkładu nadtlenku wodoru zawartego w roztworze hemolizatu krwinek przez katalazę.
- Wykonano 200-krotne rozcieńczenie hemolizatu krwinek
- Do 6 zlewek o pojemności ok. 25-50 ml odpipetowano po 2 ml 1 M H2SO4 z dodatkiem 1% MnSO4.
- Przygotowano także mieszaninę reakcyjną -> 1,5 ml rozcieńczonego hemolizatu krwinek + 15 ml 0,1 M buforu fosforanowego + 15 ml nadboranu sodu
- Natychmiast do 1 zlewki zawierającej kwas i katalizator odpipetowano 5 ml mieszaniny reakcyjnej. Resztę mieszaniny inkubowano w temperaturze pokojowej i co 3 minuty pobierano próbę i umieszczano ją w kolejnych zlewkach.
- Zawartość zlewek miareczkowano 0,02 M KMnO4
- Otrzymano następujące wyniki:
Tabela 1. Zależność zużytego titranta a ilość rozłożonego nadtlenku wodoru
Numer zlewki |
Ilość KMnO4 [ml] |
μmol H2O2 |
1 |
2,75 |
137,5 |
2 |
1,8 |
90 |
3 |
0,95 |
47,5 |
4 |
0,65 |
32,5 |
5 |
0,4 |
20 |
6 |
0,25 |
12,5 |
Wykres 1. Wykres zależności ubytku substratu od czasu.
- Wniosek z ćwiczenia : Im dłużej reakcja enzymatyczna w roztworze nie została zahamowana działaniem kwasu siarkowego, tym więcej cząsteczek substratu zostało rozłożonych na tlen i wodę. Obserwujemy to dzięki spadającej zawartości nadtlenku wodoru w roztworach.