DNA przed obliczem sądu

Paweł Buda

Określanie genetycznych cech śladu biologicznego (włosa, plamy, fragmentu tkanek) stanowi podstawowe zadanie laboratoriów kryminalistycznych. Sądy, prokuratura i policja traktują wyniki tych badań jako bardzo ważny i najbardziej obiektywny element dowodowy. Szczególne znaczenie ma tutaj badanie polimorfizmu DNA zarówno genomowego jak i mitochondrialnego. Artykuł ten przedstawia techniki stosowane przez medycynę sądową, oparte właśnie na polimorfizmie DNA.

Wstęp

Często w kryminalistyce zdarza się, że przestępca jest tak dokładny i profesjonalny w maskowaniu siebie, że rozpoznanie go staje się niemożliwe tradycyjnymi metodami śledztwa. Osoba ta, z reguły nie zdaje sobie sprawy, że pozostawia ślady na tyle niepozorne, że nie można ich dostrzec posługując się jedynie zmysłami. Z pomocą detektywom przychodzi medycyna sądowa, której wyniki badań genetycznych markerów człowieka mają wielkie znaczenie w identyfikacji śladów biologicznych oraz ustaleniu pokrewieństwa.

Ekspertyza śladu biologicznego

Wszystkie działania detektywistyczne mają pewną kolejność, która ma pozwolić na dokładne zidentyfikowanie śladu i jego pochodzenia. Na samym początku ustala się rodzaj materiału biologicznego obecnego na dowodzie rzeczowym. Narządy, tkanki, wydzieliny i wydaliny mają charakterystyczne elementy morfotyczne, związki chemiczne, struktury biochemiczne i immunologiczne, których wykrycie pozwala na stwierdzenie, że jest to np.: fragment mięśnia lub mózgu, plama krwi, nasienia, śliny, potu, moczu lub wydzielina z pochwy, śluz z nosa, wymiociny, kał. Stwierdzenie metodą spektroskopową obecności hemochromogenu jest wystarczającym dowodem na obecność krwi. Znalezienie pod mikroskopem plemników stanowi dowód, że na badanym dowodzie znajdują się plamy nasienia. W dalszej kolejności określa się przynależność gatunkową śladu biologicznego. Do tego celu służą metody immunologiczne wykorzystujące reakcję antygen-przeciwciało. W ten sposób można określić, czy badany materiał pochodzi od człowieka, psa, kota, świni, ptaka, jelenia itp. Kolejnym krokiem będzie zbadanie czy badany ślad pochodzi od kobiety czy mężczyzny. Aby określić płeć należy po prostu stwierdzić obecność chromosomu Y w materiale genetycznym. Istnieje prosta metoda, oparta na PCR, wykorzystująca różnice chromosomów X i Y. Oba chromosomy posiadają gen amelogeniny, który jest w 90 % homologiczny dla obu przypadków. Dziesięcioprocentowa różnica jest skutkiem delecji, występującej na chromosomie Y. Jeśli w PCR użyjemy takiej samej pary starterów amplifikujemy dwa odcinki DNA o różnych długościach. Krótszy o wielkości 788 pz będzie charakterystyczny dla chromosomu Y. Z kolei dłuższy o wielkości 977 pz jest swoisty dla chromosomu X. Jest to metoda bardzo czuła bowiem wystarcza obecność niewielkiej ilości chromosomalnego DNA (poniżej 400 pg). Stwierdzenie w elektroforezie mniejszego i większego produktu PCR świadczy o obecności w śladzie chromosomów X oraz Y i jest dowodem, że pochodzi on od mężczyzny. Natomiast wykrycie jedynie fragmentu dłuższego, swoistego dla chromosomu X, jest dowodem pochodzenia śladu od kobiety.

Rysunek 1. Rozdział elektroforetyczny amplifikowanych PCRem genów AMGY i AMGX. Prążek 788pz pochodzi od genu Y, 977 od genu X. 1 - obecność 2 prążków wskazuje na pochodzenie materiału genetycznego od mężczyzny; 2 - 1 prążek wskazujący DNA kobiety; M - marker.

W sprawach przestępstw seksualnych (gwałt) istotą jest stwierdzenie obecności nasienia w drogach rodnych kobiety. W tym celu także używa się testu na obecność sekwencji amelogeniny. Amplifikacja fragmentów AMGY w takim materiale wymaga najczęściej specjalnej, selekcyjnej izolacji DNA plemników. Problemem jest obecność w wymazach dużej liczby komórek nabłonka pochwy, co jest przyczyną uzyskiwania mieszaniny matryc AMGY i AMGX, z przewagą tych ostatnich. Olbrzymia dysproporcja w ilości matryc uniemożliwia powielenie fragmentów genu amelogeniny chromosomu Y. Jest jednak na to sposób tzw. metoda preferencyjnej lizy, która wykorzystuje odporność chromatyny plemników na lizę z udziałem siarczanu dodecylu sodu (SDS) i proteinazy K oraz stosunkowo łatwą lizę chromatyny somatycznej. Chromatyna plemników ssaków w miejsce histonów zawiera liczne cysteinowe protaminy. Reszty ich tworzą dużą ilość wiązań dwusiarczkowych, co zapewnia odporność na detergenty i egzogenne proteazy. Wykrycie w wymazach z dróg rodnych DNA genu AMGFjest wystarczającym dowodem na obecność nasienia. Powyższe metody pozwalają jednak jedynie na bardzo ogólną charakterystykę śladu, ograniczającą się do stwierdzenia przynależności gatunkowej, czy rozróżnienia płci. W kryminalistyce liczą się tylko szczegółowe dane, muszą więc istnieć metody bardziej wybiórcze i precyzyjne. Największe znaczenie dowodowe w badaniach kryminalistycznych śladu biologicznego ma ustalanie cech polimorficznych, które mogą prowadzić do indywidualizacji osobniczej, ustalenia tożsamości sprawcy i ofiary oraz przedmiotu przestępstwa. W tym celu ustala się obecność antygenów grup krwi, określa układy grupowe białek surowicy i enzymów oraz oznacza polimorfizm DNA. Ustalenie przynależności grupowej śladu krwi w zakresie kilku układów np.: ABO, Rh, MN, GM, HP, ACP, PGM, ESD, GLO jest jedynie w stanie wykluczyć większość osób niesłusznie podejrzanych, natomiast nie pozwala na ustalenie tożsamości osoby, od której pochodzi. Kolejnym problemem jest fakt, że ślad biologiczny jest często bardzo mały, oraz że ulega degradacji pod wpływem czynników fizykochemicznych (wilgoć, światło, temperatura, związki chemiczne). Uniemożliwia to często uzyskanie pozytywnych wyników fenotypowania z uwagi na inaktywację enzymów, degradację struktur białkowych i konfiguracji epitopów antygenowych co może fałszować różnego typu testy np. ELISA. W takich przypadkach można polegać na DNA, która jest jedną z najtrwalszych cząsteczek chemicznych wchodzących w skład organizmu. Komórki zawierające DNA można znaleźć w większości śladów biologicznych. Krótkie odcinki DNA wykrywa się nawet w bardzo starych i zdegradowanych śladach biologicznych, co pozwala np. na dokończenie często po wielu latach umorzonych już śledztw. Badając DNA oznacza się różnice w sekwencji nukleotydów. W badaniach wykorzystuje się zarówno DNA chromosomowe jak i mitochondrialne, które także posiada sekwencje polimorficzne. Ma ono nawet pewną przewagę, bowiem pozwala na odtwarzanie polimorficznych sekwencji w oparciu o śladowe ilości materiału biologicznego. Równocześnie poznanie kilkudziesięciu loci mikrosatelitarnych o wysokim stopniu heterozygotyczności umożliwia w dużym stopniu przybliżyć „profil genetyczny". Pozostaje do rozwiązania problem standaryzacji wyników, oceny ich wartości i ryzyka błędu.

Analiza DNA

Polimorfizm DNA wynika z różnic w sekwencji homologicznych odcinków DNA. Został on początkowo opisany przez Wymana i White'a 1980 roku. Jest to zjawisko polegające na występowaniu różnej długości fragmentów restrykcyjnych w homologicznych odcinkach DNA swoiście hybrydyzującymi z sondą molekularną. W chromosomalnym DNA jednej osoby stwierdzano obecność jednego lub dwóch takich fragmentów, natomiast w DNA kilkudziesięciu osób wykryto obecność 8 fragmentów różnej wielkości i kilkadziesiąt różnych genotypów. Polimorfizm ten nazwano polimorfizmem długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP). Badania polimorfizmu RFLP metodami hybrydyzacji, z zastosowaniem techniki Southerna, wymaga jednak obecności znacznej ilości niezdegradowanych cząsteczek DNA. Uzyskanie z dowodów rzeczowych niezbędnej ilości DNA do tych badań jest bardzo często niemożliwe.

Rysunek 2. Schemat analizy RFLP. (A) Powielenie sekwencji polimorficznych chromosomów homologicznych przy użyciu jednakowych starterów. (B) Porównanie układu prążków na żelu agarozowym, pozwala badać pokrewieństwo pomiędzy osobnikami.

Pierwszym przestępcą skazanym na podstawie badań RFLP był w 1987 brytyjski piekarz Colin Pitchfork, skazany za dwa morderstwa połączone z gwałtem; w 1989 doszło do pierwszego uniewinnienia w oparciu o badanie RFLP - pierwotnie skazany na podstawie relacji świadków na 50 lat więzienia za gwałt i porwanie, Amerykanin Gary Dotson został uniewinninony po przeprowadzeniu badań DNA w kilka lat po rozpoczęciu odbywania wyroku.

W 1985 roku badacz Jeffreys opisał nadzmienne regiony minisatelitarnego DNA. Używając sondy molekularnej uzyskał hybrydyzację z kilkudziesięcioma fragmentami restrykcyjnymi różnej wielkości. Przy użyciu dwóch różnych sond (33.6 i 33.15), specyficznych dla wielu loci, jesteśmy w stanie ustalić unikalny wzór fragmentów DNA badanej osoby, który można porównać z indywidualnym wzorem linii papilarnych, dlatego metoda ta została nazwana DNA fingerprint. Zainteresowanie genetyków tym tematem i prowadzone badania pozwoliły odkryć wiele rozproszonych w genomie sekwencji powtórzonych, których obecność można oznaczyć jedną sondą molekularną. Takie jednoczesne badanie fragmentów pochodzących z różnych miejsc chromosomalnego DNA nazywane jest analizą wielolokusową lub wielopunktową (ang. multi locus system, MLS). Oznaczanie różnic w homologicznych odcinkach jednego locus nazywane jest analizą jednolokusową lub jednopunktową (ang. single locus system, SLS). W ciągu kilku lat po doświadczeniach Jeffreysa, w chromosomalnym DNA człowieka odkryto tysiące miejsc wykazujących polimorfizm o wysokim stopniu heterozygotyczności. Opracowanie prostych technik hybrydyzacji i znakowania sond molekularnych oraz metody powielania techniką PCR w probówce wybranych odcinków DNA, umożliwiło praktyczne zastosowanie polimorfizmu DNA w badaniach identyfikacyjnych oraz w ustalaniu stopnia pokrewieństwa. W badaniach genetycznych dla celów sądowych wysoką wartość diagnostyczną wykazują sekwencje minisatelitarne i mikrosatelitarne.

Minisatelity

W genomie człowieka znajduje się kilka tysięcy loci z sekwencjami minisatelitarnymi. Występują one w formie rozproszonej w całym genomie, przy czym niektóre z nich mają tendencję do grupowania się w telomerowych regionach chromosomów człowieka. Jednostki rdzeniowe, złożone z 7 do 100 par zasad, powtarzają się w pojedynczym locus od 2 do kilkuset razy. Większość sekwencji minisatelitarnych nie podlegaja ekspresji, w ogóle nie są przepisywane na matrycę RNA, więc mogą w nich się gromadzić mutacje nie dające objawów fenotypowych, a powodujące powstawanie nowych alleli. I tak jest w rzeczywistości. W niektórych loci sekwencji minisatelitarnych poziom mutacji jest bardzo wysoki i sięga np. 5% dla locus d1s7 . Dotyczy on zarówno komórek somatycznych, jak i rozrodczych. Wspomniane locus charakteryzuje się najwyższą heterozygotycznością w populacji (>99%) i pulą ok. 2400 możliwych alleli, jest więc doskonałym obiektem w ustalaniu tożsamości.

Mikrosatelity

W genomie człowieka oprócz sekwencji minisatelitarnych znajduje się około sto tysięcy loci z sekwencjami mikrosatelitarnymi, które (z nielicznymi wyjątkami) okazały się specyficzne dla człowieka. Są to sekwencje złożone z jednego do sześciu nukleotydów i powtarzają się w pojedynczym locus od 5 do 100 razy. Rozłożone są równomiernie co 6 -10 kpz. W genach zwykle zlokalizowane są w sekwencjach flankujących i intronach, chociaż sporadycznie spotykane są również w sekwencjach kodujących. W badaniach dla celów sądowych znajdują zastosowanie sekwencje mikrosatelitarne o powtórzeniach trój- i czteronukleotydowych. Rozmieszczone są równomiernie w całym genomie człowieka co 300 - 500 kpz, charakteryzują się dużym zróżnicowaniem oraz małą wielkością alleli (od 100 - 400 pz). Wybór loci polimorficznych odpowiednich do ekspertyzy genetycznej dla potrzeb sądowych musi uwzględniać wiele czynników. Do podstawowych kryteriów należy stopień heterozygotyczności, częstość alleli, częstość mutacji i możliwość fenotypowania lub genotypowania oraz ryzyko błędu. Jest on uzależniony również od możliwości technicznych i metodycznych ośrodka wykonującego badania. Ze względów procesowych, zastosowanie konkretnego badania musi uwzględniać możliwość kontroli w innym ośrodku naukowym.

Rysunek 4. Schematyczny rysunek przedstawiający rozkład mini- i mikrosatelit na chromosomie.

Analiza wielolokusowa (MLS) w ustalaniu ojcostwa

Gdy zachodzi potrzeba zbadania czy pozwany w sądzie jest ojcem dziecka powódki, wykonuje się badanie polimorfizmu - multi locus system. Polimorfizm MLS bada się poprzez hybrydyzację sondy molekularnej z fragmentami DNA otrzymanymi z trawienia restrykcyjnego, które uprzednio zostały rozdzielone podczas elektroforezy. Elektroforeza i późniejsza hybrydyzacja z sondą dotyczą zarówno fragmentów matki, dziecka i domniemanego ojca. Jeśli prążki wzoru dziecka odpowiadają prążkom od matki i ojca, nie można wtedy wykluczyć pokrewieństwa pomiedzy nimi. Jeżeli we wzorze dziecka obecne są prążki, które nie występują u matki i pozwanego, istnieje podstawa do wydania opinii wykluczającej ojcostwo. Wyjątkowo, u dziecka może wystąpić pojedynczy prążek tzw. mutacyjny, nie reprezentowany we wzorach rodziców. Wyniki nie wykluczające ojcostwa mogą stanowić podstawę do oceny, czy wzór prążków dziecka, dziedziczonych od ojca, jest unikalny i czy można na jego podstawie uznać ojcostwo pozwanego za prawdopodobne, bardzo prawdopodobne, z prawdopodobieństwem graniczącym z pewnością lub nawet za udowodnione.

Analiza DNA mitochondrialnego

Mitochondrialny DNA człowieka jest dwuniciową kolistą cząsteczką zawierającą ponad 16 500 par zasad. Zarówno oocyt jak i plemnik zawierają mitochondria. Jednak potomstwo dziedziczy mtDNA tylko od matki. W komórce oocytu występują setki mitochondriów zawierające łącznie do 200 000 cząsteczek mtDNA. Mitochondrialny DNA charakteryzuje się bardzo ciasno upakowanymi genami, których transkrypty spełniają istotną funkcję w komórkowym łańcuchu oddechowym. W cząsteczce mtDNA zakodowane są 2 cząsteczki rRNA, 22 tRNA oraz 13 polipeptydów, które są elementami kompleksów fosforylacji oksydacyjnej. W mtDNA akumuluje się dużo mutacji. Wykazuje on 5 -10 razy większą różnorodność sekwencji niż DNA genomowy. Jest to wynikiem braku procesu reperacyjnego DNA oraz działania wolnych rodników powstających w procesie fosforylacji oksydacyjnej. Liczący 1200 pz, niekodujący region (ang. D-Loop region) ludzkiego mtDNA zawiera dwie domeny o wysokiej zmienności, nazywane również sekwencjami Andersena. Region HV1 zlokalizowany jest pomiędzy nukleotydami 16024 i 16365 mitochondrialnego DNA. W regionie tym stwierdzono obecność do 50 miejsc różniących się sekwencją jednego nukleotydu. Drugi region - HV2, pomiędzy 73 a 340 parą nukleotydów, wykazuje zróżnicowanie w 28 miejscach. Zamiany nukleotydów typu tranzycji obserwuje się 30 razy częściej niż zamiany typu transwersji. Badanie polimorfizmu sekwencyjnego mtDNA wykonuje się w trzech etapach.

Rysunek 3. Badanie polimorfizmu DNA mitochondrialnego (opis w tekscie).

W pierwszym izoluje się mitochondrialny DNA. Następnie powielane są nadzmienne regiony HV1 i oddzielnie HV2. Powielenie może dotyczyć całych regionów przy użyciu jednej pary starterów. Częściej jednak, przy użyciu dwóch par starterów, powielane są krótsze sekwencje, które zachodzą na siebie. W trzecim etapie badania, po dokładnym oczyszczeniu produktów amplifikacji, wykonuje się bezpośrednio automatyczne sekwencjonowanie DNA. Wyniki sekwencjonowania porównywane są z wzorcem, który stanowią sekwencje Andersena. Stopień zróżnicowania polimorfizmu sekwencyjnego mtDNA jest charakterystyczny dla danej populacji. Porównanie sekwencji między różnymi populacjami pozwala na prześledzenie historii ich pochodzenia (wzory sekwencyjne są identyczne, brak rekombinacji umożliwia ustalanie pokrewieństwa po linii matek). Badania mtDNA, np. w szczątkach pomordowanych członków rodziny cara Rosji i żyjących krewnych tego rodu, potwierdziły ich pokrewieństwo i pochodzenie fragmentów kości. Natomiast wysoka zmienność tego polimorfizmu miedzy osobami niespokrewnionymi daje olbrzymią szansę na różnicowanie pochodzenia śladów biologicznych, ewentualnie ich osobniczą indywidualizacje. Ta bardzo kosztowna metoda zyskała sobie uznanie w tych przypadkach, w których waga problemu kryminalistycznego uzasadnia jej wykonanie oraz gdy nie można przeprowadzić badań polimorfizmu mini- lub mikrosatelitarnego. Niekiedy jedynym śladem pozostawionym na miejscu morderstwa jest fragment włosa bez torebki, plemniki, niewielki fragment zniszczonej kości lub zdegradowana plamka krwi. Szansa na izolację DNA chromosomalnego jest w tych przypadkach znikoma, natomiast udaje się najczęściej uzyskać wiele kopii mitochondrialnego DNA. Upowszechnienie badań polimorfizmu mtDNA związane jest z niedużą wielkością genomu mitochondrialnego i co za tym idzie, stosunkowo łatwą jego analizą. Wstępną metodą diagnostyczną mogą być przesiewowe techniki identyfikacji mutacji, np. technika SSCP umożliwiająca identyfikacje fragmentów różniących się pojedynczą zmianą w sekwencji nukleotydów. Największe nadzieje w badaniach polimorfizmu mtDNA wiąże się jednak z możliwością automatyzacji technik molekularnych, takich jak sekwencjonowanie czy hybrydyzacj a produktów powielenia ze specyficznymi sondami oligonukleotydowymi (technika ASO).

---