LABORATORIUM Z BIOCHEMII.
Ćwiczenie nr.2
„Ochrona Środowiska”
Grupa dziekańska nr. II
Czwartek godz.: 16:15-20:00
Grupa:
Maciej Kurzyk
Magdalena Kołuda
Jacek Bogdański
Temat: Białka.
Uwagi: ______________
Ocena: ______________
Wstęp - teoria.
Białka - są to wielkocząsteczkowe (masa cząsteczkowa od ok. 10 000 do kilku mln) biopolimery zbudowane z reszt aminokwasów połączonych wiązaniem peptydowym, występujące we wszystkich organizmach roślinnych i zwierzęcych. Są zasadniczymi elementami metabolicznymi i strukturalnymi komórek, tkanek i narządów organizmów żywych.
Syntetyzowane są częściowo z aminokwasów endogennych, które ustrój może sam wytwarzać, a poza tym z aminokwasów egzogennych tzw. istotnych, pobieranych z pokarmów rozkładanych w procesie trawienia.
Dzielą się na proste (proteiny) i złożone (proteidy). Białka proste zbudowane są tylko z aminokwasów.
Białka proste dzieli się na globularne (rozpuszczalne) i skleroproteiny (białka włókniste).
Do białek globularnych zalicza się:
histony - podobnie jak protaminy są silnie zasadowe i dobrze rozpuszczają się w wodzie; składniki jąder komórkowych (w połączeniu z kwasem dezoksyrybonukleinowym), czyli są obecne także w erytroblastach. W ich skład wchodzi duża ilość takich aminokwasów jak lizyna i arginina.
albuminy - białka obojętne, spełniające szereg ważnych funkcji biologicznych: są enzymami, hormonami i innymi biologicznie czynnymi związkami. Dobrze rozpuszczają się w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli, łatwo ulegają koagulacji. Znajdują się w tkance mięśniowej, osoczu krwi i mleku.
globuliny -w ich skład wchodzą wszystkie aminokwasy białkowe, z tym że kwas asparaginowy i kwas glutaminowy w większych ilościach; w odróżnieniu od albumin są źle rozpuszczalne w wodzie, natomiast dobrze w rozcieńczonych roztworach soli; posiadają podobne właściwości do nich. Występują w dużych ilościach w płynach ustrojowych i tkance mięśniowej.
prolaminy - są to typowe białka roślinne, występują w nasionach. Charakterystyczną właściwością jest zdolność rozpuszczania się w 70% etanolu.
Skleroproteiny są to nierozpuszczalne białka szkieletowe, materiał budulcowy chrząstek, rogów, łusek, włosów itp. Należą do nich: fibroina (białko jedwabiu), kolagen (białko tkanki łącznej, ścięgna), keratyna (białko piór, włosów, kopyt, rogów).
Białka mają następujące funkcje:
kataliza enzymatyczna - od uwadniania dwutlenku węgla do replikacji chromosomów,
transport i magazynowanie - hemoglobina, transferyna, ferrytyna,
kontrola przenikalności błon - regulacja stężenia metabolitów w komórce,
ruch uporządkowany - np. skurcz mięśnia, aktyna i miozyna
wytwarzanie i przekazywanie impulsów nerwowych
kontrola wzrostu i różnicowania.
Utraty aktywności biologicznej lub innej indywidualnej cechy charakterystycznej przy zachowaniu jego struktury pierwszorzędowej nazywamy denaturacją białka - czyli zmianą w II, III- i IV-rzędowej strukturze białka natywnego.
Podczas denaturacji niszczone są wiązania wodorowe, a w obecności odczynników redukujących zerwaniu ulegają wiązania disulfidowe.
Denaturacja może być procesem odwracalnym (renaturacja) i nieodwracalnym. Przejście od natywnego, niskoenergetycznego stanu do formy zdenaturowanej związane jest ze wzrostem nieuporządkowania łańcucha, której to przemianie towarzyszy wzrost entropii.
Podczas denaturacji zachodzą także zmiany rozpuszczalności i przesunięcie punktu izoelektrycznego. Rozwinięcie łańcucha peptydowego może prowadzić do wzrostu lepkości, a także zmian absorpcji w nadfiolecie. Obserwuje się również często procesy agregacji i wytrącania, co jest związane ze zmianami stopnia hydratacji i rozpuszczalności białek.
Najważniejszymi metodami fizycznymi denaturacji są: ogrzewanie, silne mieszanie, wytrząsanie, naświetlanie promieniowaniem nadfioletowym, rentgenowskim i jonizującym lub działanie ultradźwiękami.
Denaturacja chemiczna zachodzi pod wpływem związków, które są zdolne do rozerwania wiązań wodorowych, na przykład pod wpływem roztworu mocznika o stężeniu 6-8 mol/dm³ lub chlorku guanidyny o stężeniu 4 mol/dm³, na skutek działania kwasów lub zasad (wartość pH poniżej 3 lub powyżej 9), a także soli metali ciężkich.
Białka są niezbędnym budulcem struktur komórkowych i tkankowych, u roślin często materiałem zapasowym (np. w nasionach zbóż i roślin strączkowych), stanowią także ważne składniki płynów ustrojowych. U człowieka białka stanowią ok. 56% suchej masy ciała.
Białka stanowią podłoże lub biorą udział w licznych procesach fizjologicznych: przenoszeniu i magazynowaniu różnych substancji, utlenianiu tkankowym, krzepnięciu krwi, procesach odpornościowych, procesach widzenia, przewodzenia bodźców nerwowych, skurczu mięśni, dostarczaniu energii, regulacji procesów metabolicznych, stężenia jonów, ciśnienia osmotycznego (ciśnienie onkotyczne). Wszystkie te funkcje białka spełniają dzięki odwracalnym zmianom swej struktury przestrzennej.
Wykonanie ćwiczenia. Wnioski.
I. Białka jako koloidy.
W próbce z wodą pojawiło się zmętnienie po dodaniu NaCl
W próbce z białkiem kurzym roztwór zrobił się galaretowaty, powstał osad, który po dodaniu NaCl rozpuścił się.
II. Amfoteryczność białek.
Odczynnik |
1% roztwór białka jaja kurzego |
||
|
pH=8,0 |
pH=4,7 |
pH=3,0 |
10% siarczan miedziowy |
zmętnienie |
lekkie zmętnienie |
niewielkie zmętnienie |
10% octan ołowiu (II) |
zmętnienie |
niewielkie zmętnienie |
niewielkie zmętnienie |
10% wolframian sodowy |
nic |
nic |
nic |
a) Strącanie białek za pomocą kationów i anionów
b) Wpływ kwasów organicznych na białka.
KWAS |
OBSERWACJE |
6% kwas sulfosalicylowy |
Pojawił się biały osad - wytrąciło się białko. |
10% kwas trójchlorooctowy |
Pojawiło się zmętnieni - wypadło białko. |
5% kwas octowy |
Nie zaszła zmiana. |
III. Denaturacja cieplna.
Do trzech probówek dodajemy po 2ml 1% roztworu białka kurzego (o pH 8,0; 4,7; 3,0). Umieszczamy we wrzącej łaźni na 15 minut, po czym chłodzimy i dodajemy po 5ml buforu octanowego do prób o pH 3 i 8.
Wniosek: Nie zawsze białko zdenaturowane wypada z roztworu.
IV. Wysalanie białek.
Po dodaniu do przesączu otrzymanego po oddzieleniu osadu białka 2-3 kropli kwasu trójchlorooctowego, nie pojawił się osad więc mamy całkowite wysolenie białka.
V. Reakcja biuretowa (Piotrowskiego).
Reakcja biuretowa - osad z wysolonego białka rozpuszczony w KCl.
W probówce zawierającej białko jaja kurzego pojawiło się fiołkowe zabarwienie.
W próbie z wodą zabarwienie błękitne.
VI. Izolowanie białek roślinnych.
Ekstrahowanie albumin i globulin.
- przeprowadzamy reakcję biuretową. W próbie z jajem kurzym pojawiło się granatowo-fioletowe zabarwienie
-w reakcji dla próby z ekstraktem mączki roztwór fioletowy
Stwierdzenie obecności albumin i globulin.
-W roztworze do którego dodaliśmy 8ml KCl pojawiło się zmętnienie - czyli jest to oznaka obecności globuliny.
-W próbie z wodą nie było zmętnienia - po dodaniu kolejnych kropel nie wystąpiło zmętnienie.
Wydzielanie glutenu.
Odważamy mąkę pszenną, dodajemy wody i zagniatamy kulkę ciasta. Odstawiamy na 30 minut, tak aby ciasto się związało i „odpoczęło”. Z tego ciasta pod bieżącą wodą wypłukujemy skrobię, aż do gumowatej postaci. Zalewamy tą postać w erlenmayerce roztworem wodorotlenku sodowego. Pobieramy osad do reakcji biuretowej potwierdzającą obecność białek.
Gluten występuje w postaci amidu glutaminowego i rozpuszcza się w rozcieńczonych kwasach i zasadach. Jest tak że białkiem zapasowym zbóż. W reakcji biuretowej nie dał pozytywnego wyniku.
Literatura:
Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Vicor W. Rodwell:
„Biochemia Harpera” Warszawa 2004 Wydawnictwo Lekarskie PZWL,