Odsalanie roztworu białka metodą chromatografii sita molekularnego.
Wykonanie:
Celem ćwiczenia jest poznanie metody chromatografii chromatograficznej sita molekularnego oraz praktyczne frakcjonowanie związków w oparciu o różnice w masach cząsteczkowych metodą sączenia na żelu Sephadex.
Do ćwiczeń używaliśmy złoża z Sephadexu G-25 oddzielając białko od soli azotanowej. Oznaczaliśmy zawartość białka oraz jonów azotanowych w roztworze wyjściowym nanoszonym na kolumnę oraz w eluacie metodą Lowry'ego. W tym celu wyskalowaliśmy jedną probówkę na 7 ml oraz 20 małych na 1 ml. Dodatkowo 20 probówek oznaczamy numerami 1-20.Z przygotowanej kolumny wypełnionej Sephadexem odkręcamy zacisk i odsączamy płyn znad żelu. Gdy warstwa buforu nad żelem osiągnie ok. 2 mm zakręcamy zacisk kolumny i nanosimy ostrożnie 1 ml roztworu białkowego. Gdy naniesiony roztwór prawie całkowicie wniknie w żel ponownie ostrożnie nanosimy na kolumnę 1 ml wody w celu wmycia białka i soli do wnętrza żelu. Czynność tę powtarzamy po wniknięciu i tej partii wody w żel. Następnie kolumnę nad żelem napełniamy wodą i utrzymujemy jej objętość na względnie stałym poziomie przez cały czas trwania rozdziału. Po zebraniu pierwszych 7 ml, napełniamy kolejno wyskalowane na 1 ml. Po zakończonym rozdziale zakręcić zacisk kolumny.
W drugiej części doświadczenia oznaczamy zawartość białka w próbie wyjściowej i frakcjach wycieku z kolumny metodą Lowry'ego. W tym celu przenosimy 1 ml roztworu białka do kolby miarowej na 50 ml, którą dopełniamy wodą do kreski i dobrze mieszamy. Do 2 probówek nanosimy po 0,5 ml roztworu z kolbki, a w probówce 3 robimy próbę kontrolną z 0,5 ml wody destylowanej. Z frakcji od 1 do 11 pobieramy po 0,1 ml roztworu do czystych probówek i uzupełniamy 0,5 ml wody. Do wszystkich probówek dodajemy 2,5 ml odczynnika miedziowego, worteksujemy, po 10 minutach dodajemy po 0.25 odczynnika Folina, także natychmiast worteksując. Po 30 minutach badamy intensywność zabarwienia w kolorymetrze przy długości fali 750 nm, wobec próby kontrolnej. Uzyskaną wartość absorbancji przeliczamy na μg białka.
W kolejnej części wykrywamy jony azotanowe. W tym celu do 14 probówek z frakcji 5-18 pobieramy po 0,1 ml roztworu i dodajemy po 0,2 ml kwasu salicylowego (pod wyciągiem), mieszamy i pozostawiamy w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po tym czasie dodajemy ostrożnie 2,2 ml 4 M wodorotlenku sodowego, mieszamy chłodząc pod zimną wodą. Odczytujemy absorbancję dla długości fali 420 nm.
Wyniki i obliczenia:
Dzięki spektrofotometrowi otrzymaliśmy następujące wartości absorbancji, dla danych stężeń badanego białka:
Numer frakcji |
A |
1. |
0,355 |
2. |
0,857 |
3. |
0,691 |
4. |
0,375 |
5. |
0,200 |
6. |
0,092 |
7. |
0,046 |
8. |
0,032 |
9. |
0,033 |
10. |
0,04 |
11. |
0,038 |
Σ = 2,759
Badane białko |
A1 |
A2 |
|
0,158 |
0,131 |
Do obliczeń użyliśmy A2 równej 0,131.
Dla badanej próbki, gdzie szukamy stężenia białka, wartość absorbancji wynosiła więc 0,131. Przy pomocy wykresu krzywej wzorcowej możemy otrzymać wartość szukanego stężenia białka. <tu wykresik >
W doświadczeniu wykrywaliśmy też obecność jonów azotanowych. Poniżej wyniki absorbancji z poszczególnych probówek.
L.p. |
Absorbancja |
1. |
|
2. |
|
3. |
|
4. |
|
5. |
|
6. |
|
7. |
|
8. |
|
9. |
|
10. |
|
11. |
|
12. |
|
13. |
|
14. |
|
Wnioski :
Wyniki są zajebiste i nie wiem co tu napisać :P
Obie metody są osom i wszystko wygląda ładnie i wykryło się w 100%. :P A tak na serio to nie wiem jakie wyszły wyniki, więc może Ty to napisz ;)