Ćwiczenie 1: Wprowadzenie do zagadnień immunologii.
Krążenie limfocytów:
- Limfocyty stale krążą między krwią i narządami limfatycznymi
- 80% limfocytów dostaje się do węzłów chłonnych przez wyspecjalizowane tzw. Żyłki o wysokim śródbłonku (HEV)
- pozostałe limfocyty dostają się do węzłów chłonnych doprowadzającymi naczyniami limfatycznymi razem z komórkami dendrytycznymi i antygenami
- limfocyty opuszczają węzły chłonne odprowadzającymi naczyniami chłonnymi
- krążenie limfocytów pozwala spotkać im znane antygeny a także inne subpopulacje tych komórek, co pozwala im indukować skuteczną odpowiedź immunologiczną.
HEV w węzłach chłonnych i MALT umożliwia limfocytom opuszczanie światła naczynia i wnikanie do tkanki limfatycznej.
Układ odpornościowy charakteryzuje się bardzo wysokim stopniem skomplikowania i specjalizacji. Porównywany z układem nerwowym cechuje się zbliżoną mas, posiada zdolność ”uczenia się” i zapamiętywania. U podstaw jego sprawnego funkcjonowania leży zdolność do rozróżniania, które cząstki w organizmie są własne a które obce. Gdy uwzględniamy fakt, że każda z tych grup liczy setki tysięcy złożonych związków chemicznych nie możę dziwić stwierdzenie o jego kluczowej roli w zachowaniu integralności ustroju.
Dlaczego uczymy się immunologii?
- choroby zakaźne
- mechanizmy patogenności
- stosowanie szczepień
Choroby powodowane przez zaburzenie funkcji układu odporności:
- ALERGIA czyli odpowiedź immunologiczna na czynniki niepatogenne np. ASTMA
- AUTOIMMUNIZACJA - reakcja na własne antygeny np. STWARDNIENIE ROZSIANE
- ODRZUCANIE PRZESZCZEPU - odpowiedź immunologiczna na komórki PRZESZCZEPU.
- NIEDOBORY ODPORNOŚCI - uszkodzenia układu odporności
Modyfikacja funkcji układu odporności:
- IMMUNOSUPRESJA
- IMMUNOREGULACJA
ODPORNOŚĆ:
1. Wrodzona (nieswoista):
- bariery fizyczne i chemiczne
- dopełniacz
- komórki NK
- fagocyty (neutrofile, makrofagi)
- eozynofile
- komórki tuczne
- lizozym
- białka ostrej fazy
- cytokiny (chemokiny)
- receptory Toll-podobne i inne
- komórki dendrytyczne)
2. Nabyta (swoista):
- humoralna (komórki B) - przeciwciała
- CMI (komórki T)
Cechy odporności wrodzonej:
- istnieje od urodzenia
- obecna u wszystkich zwierząt
- reaguje tylko przeciwko substancjom drobnoustrojów
- jej swoistość polega na rozpoznawaniu makromolekuł występujących tylko na drobnoustrojach („wzory molekularne związane z patogenami” - PAMP)
- warunkuje skuteczną odpowiedź odporności nabytej
Cechy odporności nabytej:
- swoistość
- różnorodność
- pamięć
- wzmożona odpowiedź przy kolejnym kontakcie z tym samym antygenem
- samoograniczenie
- rozróżnienie między swój - obcy.
Cele odpowiedzi immunologicznej:
- rozpoznanie antygenu (np. drobnoustroju)
- usunięcie antygenu z organizmu
- wytworzenie pamięci immunologicznej na dany antygen
Klasyfikacja CD:
- oparta na identyfikacji pojedynczych epitopów przy użyciu przeciwciał monoklonalnych (1-2)
- CD to przede wszystkim antygeny różnicowania komórek i ich receptorów
- inne markery CD to: różne białka, enzymy, kompleksy lipidowe, cząsteczki adhezji itd.
- większość, ale nie wszystkie CD występują na powierzchni komórkę
- markery CD dotyczą przede wszystkim komórek hemopoetycznych
- aktualnie CD to ok. 250 markerów
- nomenklaturę CD uzgodniono w 1982 roku
Komórki odporności wrodzonej:
- NK (Natura Killer)
- duże ziarniste limfocyty (LGL) z ekspresją CD16 i CD56
- lizują komórki nowotworowe i zakażone wirusem (spontaniczna cytotoksyczność)
- 5-10% limfocytów krwi obwodowej
- komórka NK niszczy komórkę tarczową tworząc w niej otwory przy udziale perforyn.
- ich cytotoksyczność jest hamowana przez konwencjonalną ekspresję antygenów MHC na komórkach docelowych
- u osób z podwyższoną liczbą komórek NK - przypadki nowotworów są rzadsze.
- subpopulacje wykazują ekspresję aktywujących (KAR) i/lub hamujących receptorów (KIR) dla antygenów MHC klasy I
- znajdują się we krwi, śledzionie, płucach, przewodzie pokarmowym, macicy.
- aktywowane przez IL-2, IL-12, IL-15, IL-18
- zabijają komórki docelowe via perforyny/granzymy i receptory indukujące apoptozę.
Efekt cytotoksyczny komórek NK:
- jest regulowany przez dwa sygnały z powodu występowania dwóch receptoró: KIR (hamujący) i KAR (aktywujący)
- azurofilne ziarnistości komórek NK zawierają wiele toksycznych związków - perforyny, proteazy serynowe (granzymy), NKCF, białko TIA-1.
- zabijanie dokonuje się po przyłączeniu się do komórki docelowej
- aktywowane NK posiadają ekspresję FasL i zabijają na drodze apoptozy (Fas-FasL)
- należą do komórek ADCC bo posiadają receptor dla fragmentu Fc immunoglobuliny.
Subpopulacje limfocytów:
Definiowane na podstawie ekspresji typowych markerów powierzchniowych:
- komórki T: CD3, TCR, CD4, CD8, CD45.
- limfocyty B: slg
- komórki NK: brak CD3/slg, CD16, CD56.
Komórki odporności swoistej:
Limfocyty T i B to główne komórki odporności swoistej
- komórki T CD4 (T helper)
- wzmagają stymulację komórek B I syntezę przeciwciał
- aktywują makrofagi
- Komórki T CD8 (t cytotoxic/suppresor/regulator)
- zabijają komórki z ekspresją ocego antygenu
- regulują odpowiedz immunologiczną
- Komórki B
- po stymulacji jako plazmocyty syntetyzują przeciwciała
- mogą prezentować antygen (APC)
Główna funkcja komórek zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną:
- limfocyty B - rozpoznanie antygenu i produkcja przeciwciał
- plazmocyty - produkcja przeciwciał
- limfocyty Th - pomoc w odpowiedzi immunologicznej, produkcja cytokin
- limfocyty Treg - hamowanie odpowiedzi immunologicznej, produkcja cytokin
- limfocyty Tc - zabijanie komórkę docelowych
- komórki NK - zdolne do zabicia komórek zainfekowanych wirusem i nowotworowych
- komórki dendrytyczne - prezentują antygeny limfocytom
Markery i rodzaje limfocytów B:
- Markery CD: CD19, CD20, CD21, CD22, CD35, CD40, CD72, CD80, CD86
- limfocyty B1: B1a (CD45+) i B1b (CD5-)
- limfocyty B1 stanowią około 20% limfocytów B we krwi obwodowej i śledzionie u zdrowych ludzi - wydzielają tylko IgM
- limfocyty B2: stanowią większość immunokompetentnych komórek B.
Aktywowane limfocyty T CD4+ TH1:
- stymulują makrofagi (m-fagi) do zabijania sfagoytowanych bakterii (IFNγ i CD40L)
- zabijają przewlekle zakażone komórki, uwalniając bakterie usuwane następnie przez m-fagi (FasL, LT)
- indukują proliferację komórek T (Il-2)
- indukują różnicowanie m-fagów w szpiku kostnym (IL-3, GM-CSF)
- aktywują śródbłonku, co warunkuje wiązanie monocytów i wyjście ze światła naczynia (LT, TNFalfa)
- powodują gromadzenie się makrofagów w miejscu infekcji (chemokina MCF)
Limfocyty T regulatorowe:
- limfocyty Th2 - wydzielają IL-4
- limfocyty Th3 - wydzielają TGF-beta
- Tr1 cells - wydzielają IL-10
- limfocyty T CD4+, CD25+, Foxp3
- limfocyty T CD8+, CD28-
- niektóre cytotoksyczne limfocyty T
- niektóre limfocyty T gamma/delta
- limfocyty NKT
Limfocyty T cytotoksyczne:
- limfocyty T alfa/beta CD8+
- limfocyty Th1 alfa/beta CD4+
- limfocyty T gamma/delta (CD+, CD4-, CD8-, CD16+)
- komórki NKT (CD3+, CD4-, CD8-, CD56)
- komorki Nk (CD2+, CD3-, CD4-, CD56, CD16+)
Zapewniają ochronę przed:
- większością wirusów
- niektórymi bakteriami (np. Listeria monocytogenes, Mycobacterium tuberculosis)
- pasożytami (np. Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondi, Plasmodium falciparum)
- nowotworami
Biorą udział lub powodują:
- reakcje nadwrażliwości takie jak: niszczenie tkanek w przypadku wielu chorób infekcyjnych (gruźlica!)
- niektóre choroby autoimmunizacyjne
- odrzucanie przeszczepów
- chorobę dawcy przeciwko biorcy (Graft-vs-host disease)
Czynniki cytotoksyczne ziarnistości limfocytów:
Ziarnistości cytolityczne są produktem aparatu Golgiego.
- perforyna - glikoproteina (556 amimokwasó) podobna do skłądnikó C8-C9 dopełniacza, zależna od jonów Ca, jej polimeryzacja prowadzi do tworzenia kanałów w błonie komórkowej.
- granzymy (fragmentyny) - proteazy serynowe. Wnikają do komórki przez kanały perforynowe, indukują apoptozę. Hydrolizują składniki macierzy pozakomórkowej.
- granulolizyna - należy do sapozyn, białek wiążących lipidy, niszczy błony komórkowe i mitochondrialne.
Funkcje efektorowi komórek CTL:
1. cytotoksyczność
- wydzielanie ziarnistości (perforyny, granzymy)
- Fas/FasL, TNF/TNF-R
2. zapalenia i oporność
- produkcja cytokin i chemokin (IFN-gamma, TNF-alfa, MIP1-beta i alfa, RANTES)
- aktywacja makrofagów
- bezpośrednie działanie przeciwwirusowe.
Cytotoksyczność zależna od przeciwciał:
- jest spowodowana występowaniem receptora Fc dla IgG na komórkach efektorowych (wykonawczych)
- receptor Fc wiąże przeciwciało związane z komórką docelową, co pozwala na bezpośredni kontakt między komórką efektorową a docelową
- komórki posiadające receptor Fc są nazywane zabójcami (K-cells)
- do komórek K należą: komórki NK, limfocyty T, monocyty, eozynofile, inne komórki mieloidalne.
Komórki prezentujące antygen:
- w odróżnieniu od innych, komórki TH tylko rozpoznają antygen, który w prawidłowo przebiegającej reakcji jest jej prezentowany w kontekście cząstek MCH przez inne komórki
- to są właśnie APC
- APC obejmują monocyty/makrofagi, komórki B, fibroblasty i komórki dendrytyczne
Charakterystyka antygenów:
- historycznie nazwa pochodzi od: antibody generators
* cząstki które pobudzają wytwarzanie przeciwciał i receptorów i swoiście się z nimi wiążą
- współcześnie rozróżniamy pomiędzy:
- antygenem - cząstką wiążącą swoiście przeciwciało lub receptor TCT lub BCR
- immunogenem - cząstką która może pobudzać reakcje odpornościową
- najlepszymi antygenami/immunogenami są białka o m.cz. powyżej 10 000
1. naturalne- antygeny związane z komórkami i drobnoustrojami (białka, gliko- i lipoproteiny, wielocukry)
2. sztuczne- proste związki syntetyczne
3. syntetyczne- syntetyczne polimery aminokwasów o prstej budowie
Antygeny ze względu na obcość można podzielić na:
- syngeniczne - izogeniczne - u bliźniąt jednojajowych
- allogeniczne - u osobników tego samego gatunku
- ksenogeniczne - u przedstawicieli różnych gatunkó.
Antygen heterogeniczny (heterofilny) - np. antygen Forssmana, występujący na powierzchni krwinek czerwonych niektórych gatunków zwierząt i na powierzchni bkterii. Gatunki nie posiadające tego antygenu (człowiek, królik, szczur) wytwarzają przeciwciała heterofilne przeciwko niemu.
Antygen sekwestrowany:
- autoantygen oddzielony anatomicznie od układu odpornościowego (tyreoglobulina, miozyna, antygen nabłonka plemnikotwórczego, białka szklistki)
- istotne przy zniesieniu bariery sekwestracyjnej w patogenezie autoimmunizacji
Hapten:
- cząstka o małej m.cz. niezdolna do wywołania odpowiedzi, zdolna do reakcji z produktami tej reakcji
- wywołuje odpowiedz immunologiczną i spełnia funkcję typowego antygenu po połączeniu z nośnikiem, zazwyczaj białkowym. Przykład: penicylina G
Antygeny:
- TD - grasiczozależne
- TI-1 - grasiczoniezależne 1 - poliklonalne aktywatory limfocytów B (LPS, dekstran)
- TI-2 - poliwalentne, częściowo grasiczoniezależne (filol., polisacharydy pneumokoków i inne)
Determinanty antygenowe rozpoznawane przez komórki B i Ab
* Budowa i charakter substancji
- białka, polisacharydy
- sekwencja AA - determinanta liniowa
- determinanta konfirmacyjna
- wielkość 4-8 reszt aminokwasowych
Cząsteczki wiążące antygen:
- błonowe Ig
- receptory limfocytów T (TCR, T-cell receptors)
- HLA (MHC) klasy I
- HLA (MHC) klasy II
- cząsteczki wrodzonej odporności (lektyny i inne)
Superantygen - przykłady:
- enterotoksyna gronkowcowa gł. A i B
- gronkowcowa toksyna wstrząsu septycznego
- gronkowcowa toksyna złuszczająca
- egzotoksyna paciorkowcowa
- paciorkowcowe białko M
a także produkty Yersinia pseudotuberculosis, M. tuberculosis, Mycoplasma arthritidis, Toxoplasma gondii oraz wirusów
Czym są przeciwciała?
- białka swoiste wobec antygenu, wytwarzane przez komórki plazmatyczne
- należą do nadrodziny immunoglobulin
- krążą we krwi i chłonce
- tworzą BCR (IgM i IgD)
- wiążą patogenny i ich toksyny w przestrzeni zewnątrzkomórkowej
- gigantyczny repertuar Ab
- wydzielnicza forma immunoglobulin
Budowa przeciwciał:
- Ab są glikoproteinami zbudowanymi z 4 łańcuchów polipeptydowych i węglowodanów
- struktura:
- 2 identyczne łańcuchy ciężkie (H)
- 2 identyczne łańcuchy lekkie (L)
- typowa budowa „Y”
- pojedynczy łańcuch polipeptydowi składa się z 2 regionów:
- ZMIENNEGO
- N-terrminalny
- z miejscem wiążącym Ag
- STAŁEGO
- C-terminalny
- miejsca wiązania receptorów powierzchniowych komórek i dopełniacza
- łańcuchy polipeptydowi są połączone wiązaniami disulfidowymi
- cząstka Y może być cięta proteazami na:
- fragment wiążący Ag - Fab
- fragment krystalizujący - Fc
Generacja różnorodności przeciwciał
- repertuar Ab u każdego z nas jest większy niż 1016
- immunoglobuliny przełamały regułę: jeden gen = jedno białko
- w przeciwnym wypadku większość naszego genomu byłąby odpowiedzialna za kodowanie biosyntezy przeciwciał.
Zróżnicowanie tworzą:
- rearanżacja genów
- różnorodność wiązań krzyżowych
- różnorodność kombinacyjna (łańcuchów H i L)
- hipermutacje somatyczne dojrzewanie powinowadztwa
Odmiany przeciwciał:
1. izotypowe
- różnice w budowie łańcuchów lekkich i ciężkich będące podstawą podziału na klasy i typy
2. allotypowe
- zależne od obecności w częściach stałych łańcuchów ciężkich i lekkich różnych aminokwasów w określonej pozycji łańcucha polipedydowego
- wykrywane są one u osobników tego samego gatunku
3. idiotypowe
- związane z różnicą budowy części zmiennej łańcuchów
- przeciwciała o tej samej swoistości mają te same markery idiotypowe.
Klasy (izotopy) immunoglobulin
Podział na klasy bazuje na cechach regionu stałego ŁAŃCUCHA CIĘŻKIEGO:
- immunoglobuliny A
- immunoglobuliny D
- immunoglobuliny E
- immunoglobuliny G
- immunoglobuliny M
* różnice we własnościach łańcuchów ciężkich
* długość fragmentu stałego, lokalizacja wiązań disulfidowych, region zawiasowy, zawartość węglowodanów
* Ig różnych klas mają odmienne funkcje efektorowe
„Parametry” przeciwciał:
- Wartościowość przeciwciała - liczba determinant antygenowych jakie może związać cząsteczka przeciwciała. IgG, IgD mają dwa miejsca wiązania antygenu, są więc dwuwartościowe.
- Powinowactwo - siła wiązania pojedynczej determinanty antygenowej. Przeciwciała o tej samej swoistości do antygenu mogą różnić się powinowactwem do tegoż antygenu (ścisłością, stopniem dopasowania do antygenu).
- Awidność (zachłanność) - siła wiązania wielowartościowego antygenu przez przeciwciała.
Przeciwciała IgM w odpowiedzi immunologicznej:
- wytwarzane jako pierwsze w odpowiedzi humoralnej
- wytwarzane zanim w komórkach B zajdzie hipermutacja somatyczna
- występuje jako pentametr z łańcuchem J
- jako pierwsze we krwi
- aktywuje dopełniacz
Przeciwciała IgG w odpowiedzi immunologicznej:
- syntetyzowane jako wtórne
- główna klasa Ab we krwi i płynach (75%)
- 4 podklasy (1-4)
- IgG1 i IgG3 są silnymi opsoninami
- biorą udział w reakcjach nadwrażliwości
- przechodzą przez łożysko
Przeciwciała IgA w odpowiedzi immunologicznej:
2 podklasy (IgA1 i IgA2) i 2 formy (monomer i dimer)
* IgA1
- 85% surowiczych IgA
- monomer
- reaguje z Ab białkowymi
- aktywuje alternatywnie dopełniacz
* IgA2
- 15% surowiczych IgA
- dimer
- łańcuch J jak w IgM oraz fragment S.C.
- wysoki poziom na powierzchni błon śluzowych i w wydzielinach
- reaguje z polisacharydami i LPS
Przeciwciała IgD w odpowiedzi immunologicznej:
- 1% Ig
- krótki czas półtrwania
Przeciwciała IgE w odpowiedzi immunologicznej:
- niskie stężenie w surowicy
- wysoka koncentracja na powierzchni komórek tucznych, wiązanie przez FceRll
- w reakcji swoistej z alergenem degranulacja komórki tucznej
Przeciwciała monoklonalne:
Przeciwciała wytwarzane przez komórki tylko jednego klonu, swoiście rozpoznające tylko jedną determinantę antygenową nazywamy przeciwciałami monoklinalnymi (MAb).
Metoda otrzymywania MAb została opracowana przez Milsteina i Kohlera, którzy stworzyli hodowlę komórek mających zdolność nieograniczonej produkcji przeciwciał o określonej swoistości. Dokonali oni połączenia (fuzji) dwóch rodzajów komórek: limfoblastów B uzyskanych ze śledziony immunizowanej myszy oraz komorek szpiczaka. Tak powstała komórka potomna (hybrydoma) ma zdolność produkcji określonego typu przeciwciał (cecha uzyskana od limfoblastów B) i nieograniczonego namnażania (cecha komórek szpiczaka).
Do fuzji zastosowano komórki szpiczaka wykazujące niedobór kinezy tymidynowej (TK) oraz transferazy hipoksantyno-gunino-fosforybozylowej (HGPRT) natomiast komórki plazmatyczne nie wykazują defektów i kompensują ten niedobór po fuzji w hybrydoma. Żaden z tych dwóch enzymów nie jest niezbędny do przeżycia i rozwoju komórek w normalnych warunkach hodowli. Jeżeli jednak tor syntezy pirymidyny i puryny zostanie zablokowany np. przez aminopterynę ich niedobór staje się śmiertelny dla komórki. Tak więc w warunkach hodowli z zastosowaniem podłoża zawierającego HAT przeżywa tylko hybrydoma będąc po selekcji i namnożeniu nieograniczonym źródłem żadanego MAb.
1