Mikrobiologia przemysłowa
Ćwiczenie nr 2- Dezintegracja komórek mikroorganizmów- metody mechaniczne
Aby wyizolować białka otrzymane np. w systemach nadekspresji w komórkach drobnoustrojów potrzebne są odpowiednie metody, które pozwalają na uwolnienie danego białka z komórki z dużą wydajnością przy jednoczesnym zachowaniu jego własności np. aktywności enzymatycznej, struktury itp. Szczególnie pleśnie i drożdże, ale również komórki roślinne posiadają odporną na lizę ścianę komórkową, która utrudnia izolację białek i innych składników komórkowych. Wyodrębnienie związków chemicznych zawartych we wnętrzu mikroorganizmów wymaga zniszczenia ciągłości ścian komórkowych i błon cytoplazmatycznych w stopniu umożliwiającym wypłynięcie chronionej przez nie zawartości. Do tego celu służą różne metody dezintegracji komórek.
Kryteria i efektywność procesu dezintegracji
Dezintegracja komórki reprezentuje proces nieodwracalnego niszczenia jej anatomicznego bytu. Z doświadczalnego punktu widzenia uszkodzenie ściany komórkowej można uzyskać korzystając z różnych czynników : fizycznych, mechanicznych, chemicznych, enzymatycznych i biologicznych. W większości przypadków, po procesie dezintegracji, jest wymagane izolowanie morfologicznych i funkcjonalnie nietkniętych wewnątrzkomórkowych struktur. Z tego powodu, proces dezintegracji powinien być nie tylko skuteczny, ale musi również zapewnić brak funkcjonalnych i strukturalnych strat izolowanych białek czy innych komponentów.
Wymagania danego procesu dezintegracji określają prowadzone badania. Wybór stopni kontroli i kryteriów dla oszacowania konkretnych właściwości rozpadu docelowych składników komórki, zależy od specyficzności jaką chcemy uzyskać w eksperymencie.
Podział metod dezintegracji
Metody używane do niszczenia komórek mikroorganizmów mogą być sklasyfikowane jako mechaniczne (sonikacja, młyn perełkowy, homogenizacja) i niemechaniczne (traktowanie kwasami, zasadami, detergentami takimi jak siarczan dodecylu albo Triton X-100, rozpuszczalnikami organicznymi jak aceton, etanol czy toluen, szok osmotyczny, enzymatyczne trawienie lizozymem, glukonazami lub protezami czy proces fizycznego zamrażania - odmrażania ).
Z szerokiego spektrum stosowanych technik, nie wszystkie są odpowiednie do stosowania na dużą skalę. Przykładem jest użycie ultradźwięków (rodzaj mechanicznej procedury). Zanurzona w roztworze końcówka aparatu wywołuje „fale ciśnienia” mechanicznie niszczące cząsteczki zawiesiny. Jednakże zasadnicze znaczenie dla efektywności dezintegracji ultradźwiękowej ma proces nazywany kawitacją, czyli formowania się i implozji mikroskopijnych „baniek próżni”. Powstają one podczas „cofania” się końcówki i są następnie wypychane w głąb roztworu kolejnym „uderzeniem” końcówki. Lokalne „fale ciśnienia” wywołane przez gwałtownie implodujące „bańki próżni” potęgują proces dezintegracji i powodują, że odbywa się on nie tylko przy samej końcówce, ale nawet w pewnej od niej odległości. Metoda ta jest często używana na skalę laboratoryjną, ale duża ilość wymaganej energii i inne problemy np. cieplne, generalnie uniemożliwiają wykorzystywanie tej metody na skalę przemysłową. Ponadto, kiedy wybieramy metodę dezintegracji komórki, musimy brać pod uwagę potencjalny wpływ danej metody na ogólny schemat oczyszczania w końcowym etapie, np. strącanie solami i hydrofobowa chromatografia, nie mogą zostać wykonane w obecności detergentów. Czynniki takie jak typ mikroorganizmu, wzrost i warunki przechowywania komórek także mają duże znaczenie w wyborze metody dezintegracji. Jednakże, wybrana procedura musi pozwalać na połączenie wysokiego poziomu wydajności, efektywności z krótkim czasem niszczenia osłon komórkowych.
Skuteczność poszczególnej metody jest zazwyczaj oszacowywana poprzez stopień uszkodzenia komórki i poziom specyficznej aktywności enzymu w uzyskanej zawiesinie- ekstrakcie.
a.) Metody mechaniczne
Mechaniczne rozrywanie ściany komórek przeprowadza się w urządzeniach, które można podzielić na dwie grupy:
urządzenia bez elementów rozdrabniających:
- prasy (homogenizatory) wysokociśnieniowe,
- dezintegratory ultradźwiękowe,
2) urządzenia z elementami rozdrabniającymi ( kulkami):
- wibratory wstrząsowe,
- młyny perełkowe
Niewątpliwie mechaniczne metody są najskuteczniejsze w procesie dezintegracji komórek na małą i dużą skalę. Są one zazwyczaj mniej specyficzne i działają mocniej od metod niemechanicznych. Najczęściej używanymi urządzeniami wykorzystywanymi w tej metodzie są: homogenizator (Manton Gaulin, French Press, Braun Homogenizer), młyny perełkowe (np. KLD Dyno- Mill) oraz dezintegrator ultradźwiękowy. Homogenizator wyposażony w napędzaną powietrzem lub silnikową pompę, pozwala na ekspozycję komórek na ciśnienie aż do 2000 atm., sprężając je wbrew ograniczającej kryzie. Za dezintegrację komórki, w tym przypadku, odpowiada wygenerowana przy takim działaniu hydrodynamiczna deformacja. Niszczenie przy pomocy szklanych kulek jest również dobrą techniką. Ta procedura jest szczególnie skuteczna w dezintegracji komórek drożdży i grzybów, które mają sztywne ściany komórkowe, utworzone głównie z polisacharydów ( 80- 90 %). Ponadto, proces ten może działać w trybie ciągłym [14]. Używając młyna perełkowego możemy operować takimi czynnikami jak: ilość i wielkość kulek, rodzaj materiału, z jakiego są wykonane.
Dezintegracja ultradźwiękami
W dezintegratorach ultradźwiękowych proces rozdrabniania mikroorganizmów polega na przejściu fali dźwiękowej przez zawiesinę komórek. Powoduje to lokalne zmiany ciśnienia, które są przyczyną tworzenia się pęcherzyków. Pęcherzyki rosną do wielkości ok. 10 μm, zaczynają drgać, a następnie implodują, tworząc falę uderzeniowa o ciśnieniu kilku tysięcy atmosfer i wysokiej temperaturze lokalnej. Komórki poddane działaniu tych fal ulegają rozbiciu.
Dezintegracja w młynie perełkowym
Metoda ta polega na mokrym mieleniu w młynie perełkowym gdzie możemy wykorzystywać perełki wykonane z różnych materiałów, zwykle szklane lub z tworzyw sztucznych, o różnej średnicy (od 0,1 do 2,0 mm). Zbiornik takiego młyna jest wypełniony kuleczkami, między którymi w czasie cyrkulacji wsadu wywołanego mieszadłem odbywa się rozdrabnianie. Dezintegracja przebiega z udziałem kilku mechanizmów rozdrabniania: ścieranie, ścinanie, zgniatanie, uderzanie. W trakcie procesu dezintegracji w młynie perełkowym następuje rozrywanie i niszczenie ścian komórkowych mikroorganizmów, uwalnianie struktur wewnątrzkomórkowych, deformacja uwolnionych związków wielkocząsteczkowych oraz oddziaływanie uwolnionych enzymów między sobą. Najistotniejszym czynnikiem wpływającym na efektywność rozrywania komórek jest stopień wypełnienia młyna elementami rozdrabniającymi, jak również rodzaj materiału, z którego są wykonane. Stopień rozdrobnienia mikroorganizmów oraz temperaturę procesu można regulować przez zmianę:
- średnicy i typu kulek,
- prędkości obrotowej wału mieszadła,
- natężenia przepływu zawiesiny oraz natężenia przepływu cieczy chłodzącej komorę boczną.
Zadanie 1.1. Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych z wykorzystaniem dezintegratora.
Materiały: drożdże piekarskie , bufor Tris 50mM pH 7.0.
Porcję drożdży piekarskich (10g) zawiesić w 50 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać i odwirować (5 min w 4000 rpm) w temperaturze 4oC.
Osad zawiesić w małej ilości schłodzonego buforu. Umieścić w lodzie.
Naczynie dezintegratora wypełnić do około połowy szklanymi kulkami, uprzednio schłodzonymi. Następnie przenieść do niego zawieszone w buforze komórki i dopełnić buforem prawie do pełna. Naczynie ochronne wypełnić lodem. Aparat zabezpieczyć sprężynami.
Cykl dezintegracji trwa 3 min.
Po zakończeniu dezintegracji przenieść ekstrakt komórkowy do cylindra miarowego (zanotować objętość uzyskanego ekstraktu).
Do dwóch probówek wirówkowych przenieść po 5 ml ekstraktu i odwirować fragmenty komórek przez 5 min w 6000 rpm. W powstałym ekstrakcie bezkomórkowym sprawdzić stężenie białka.
Zadanie 1.2. Otrzymywanie ekstraktów bezkomórkowych poprzez rozcieranie materiału biologicznego w moździerzu.
Materiały: drożdże piekarskie , bufor Tris 50mM pH 7.0.
Porcję drożdży piekarskich (10g) zawiesić w 50 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszać i odwirować (5 min w 4000 rpm) w temperaturze 4oC.
Osad zawiesić w 3 ml schłodzonego buforu, przenieść do porcelanowego moździerza umieszczonego w lodzie.
Dodać oczyszczony piasek morski i energicznie ucierać przez 15 minut.
Po zakończonym procesie dezintegracji do uzyskanej mieszaniny dodać kolejne 7 ml buforu (objętość całkowita 10 ml).
Do dwóch probówek wirówkowych przenieść po 5 ml ekstraktu i odwirować fragmenty komórek przez 5 min w 5000 rpm. W powstałym ekstrakcie bezkomórkowym sprawdzić stężenie białka.
Ocena skuteczności procesu dezintegracji- pomiar ilości białka uwolnionego z komórek drożdży- Metoda Bradforda
Odczynnik Bradforda:
100mg błękitu Coomasie Blue G rozpuszczono w 50ml 95% etanolu, następnie dodano 100ml 85% kwasu fosforowego i uzupełniono do objętości 1litra wodą destylowaną.
Sporządzenie krzywej standardowej
Przygotować 1 ml wzorcowego roztworu albuminy o stężeniu 1mg/ml.
Następnie sporządzić 1 ml roztworu albuminy o stężeniu 0.2mg/ml w probówce eppendorfa.
W kolejnych probówkach eppendorfa umieścić 1 ml odczynnika Bradforda i kolejno następujące objętości roztworu albuminy (0.2 mg/ml): 5μl, 10μl, 15μl, 20μl, 30μl, 50μl. Zawartość probówek dokładnie wymieszać.
Po upływie 5 min mierzyć absorbancję przy 595nm wobec próby kontrolnej zawierającej tylko 1 ml odczynnika Bradforda.
W każdej z prób wyznaczyć ilość białka (mg) i sporządzić wykres zależności ilości białka od absorbancji- krzywa standardowa.
2. Oznaczanie ilości białka w ekstrakcie bezkomórkowym metodą Bradforda.
W kolejnych próbówkach eppendorfa umieścić po1 ml odczynnika Bradforda
Następnie dodawać odpowiednie ilości badanego roztworu otrzymanego po dezintegracji: 5μl, 7μl, 10μl, 15μl, 20 μl. Zawartość probówek dokładnie wymieszać.
Po upływie 5 min zmierzyć absorbancję przy 595nm wobec próby kontrolnej (odczynnik Bradforda).
Korzystając z krzywej standardowej, obliczyć ilość białka uwolnioną z komórek drożdży w wyniku procesu dezintegracji (mg).
Wyszukiwarka