MIKROBIOLOGIA
ĆWICZENIA 1-2
Komórki bakteryjne:
wielkość 0,4-1 μm
długość0,5-5 μm
kształt: kulisty, cylindryczny, spiralny
Kształt kulisty:
- ziarniaki Micrococcus - pojedyncze
- dwoinki Diplococcus - we wspólnej otoczce lub bez
- czwórniak Tetracoccus - wiązania międzykomórkowe
- paciorkowce Streptococcus - łańcuchy, paciorki
- pakietowce Sarcina - kostki
- gronkowce Staphylococcus - nieregularne układy komórek
Kształt cylindryczny:
- pałeczki Bacterium - okrągłe brzegi
- laseczki Bacillus
- maczugowce Corynebacterium
- prątki Mycobacterium
Kształt spiralny:
- krętki Spirochaeta
- śrubowce Spirillum
- przecinkowce Vibrio
Inne:
- promieniowce Actinomyces
Rodzaje mikroskopów:
świetlny w jasnym polu widzenia
- światło białe
- preparat przyżyciowy lub utrwalony
- obiekt na jasnym tle
obserwacje kształtów i wielkości kom.
świetlny w ciemnym polu widzenia
- światło białe
- preparat przyżyciowy
- obiekt na ciemnym tle
- obserwacja kształtów i wielkości kom.
kontrastowo-fazowy
- promieniowanie ultrafioletowe
- specjalny kondensator
- preparat przyżyciowy
- obserwacje komórek i struktur komórkowych
fluorescencyjny
- promieniowanie ultrafioletowe
- preparat utrwalony
- znakowanie fluoresceiną drobnoustrojów lub badanych molekuł
- detekcja mikroorganizmów w komórkach, tkankach lub wymazach klinicznych
elektronowy transmisyjny (TEM)
- strumień elektronów
- preparat utrwalony i wysuszony
- dwuwymiarowy obraz obiektu
- obserwacje wirusów i ultrastruktur komórkowych
- zd. rozdz. 0,0002μm (0,2 nm), powiększenie 200 000x
elektronowy skaningowy (SEM)
- strumień elektronów
- preparat utrwalony, wysuszony i napylony
- trójwymiarowy obraz obiektu
- obserwacje struktur powierzchniowych u wirusów i komórek
- zd. rozdz. 0,02μm (20 nm), powiększenie 10 000x
Wszystkie poza elektronowymi mają zdolność rozdzielczą 0,2μm i powiększenie 1000x
MIKROSKOP ŚWIETLNY
- części mechaniczne
statyw
stolik przedmiotowy
tubus
tarcza rewolwerowa (zwrotnica)
śruba makrometryczna - do ustawianie konturów
śruba mikrometryczna - do ustawiania ostrości
- części optyczne
a.) system powiększający
obiektyw (złożony z kilku soczewek powiększa obraz) - powiększenie 5-100x; obraz powiększony, rzeczywisty, odwrócony; pod 100x tzw. mokry (immersyjny) - współczynnik załamania światła (n) jest znacznie wyższy od (n) powietrza a podobny do (n) szkła soczewki obiektywu. Takie wypełnienie niweluje zjawisko podwójnego załamania światła przy przechodzeniu promienia ze środowiska optycznie gęstszego (szkło) do rzadszego (powietrze) i pozwala uzyskać lepsza ostrość obrazu
okular - dwie soczewki płasko-wypukłe; powiększenie maksymalne 25x; obraz powiększony pozorny, prosty.
Całkowite powiększenie jest iloczynem powiększenia obiektywu i okularu(max. 100x25= 25000x)
b.) urządzenie oświetlające
aparat Abbego, składający się z kilku soczewek w kondensatorze i przesłony (diafragmy) - umożliwia regulację i skupianie wiązki światła
źródło światła
Podział preparatów:
a.) przyżyciowe, tzw. mokre, natywne
- szybki ogląd, określenie wybranych cech (ruchu) lub serologicznych (aglutynacja)
- nietrwałe i dają gorszy obraz (żywe drobnoustroje słabo załamują promienie świetlne)
- odmianą są preparaty „w kropli wiszącej” i odciskowe
- na szkiełkach z p.f. (na podłożu płynnym bez p.f.)
b.) utrwalone i barwione
- dokładniejsze badania
- określenie kształtów, układów oraz wielkości drobnoustrojów
- odpowiednim barwieniem można obserwować pewne komponenty komórkowe (rzęski, endospory, ziarnistości mat. zapas.)
Wykonanie preparatu:
1.odtłuszczenie z obu stron, wytarcie flanelką
2. kropla p.f. na środek
3.pobranie bakterii opaloną ezą
4. wyschniecie na powietrzu
5. utrwalenie przeciągnięciem 3x przez palnik
PODZIAŁ TECHNIK BARWIENIA:
1. W zależności od właściwości i ziarnistości barwnika:
pozytywne - drobnocząsteczkowe barwniki do wnętrza komórki, tło bezbarwne; np. fiolet krystaliczny, błękit metylenowy
negatywne - gruboziarniste barwniki kwaśne, barwiące tło; używane do bakterii trudno barwiących się, np. śrubowców i spiralnych; np. tusz chiński, nigrozyna, czerwień kongo
pozytywno-negatywne - obserwowanie struktur zewnątrzkomórkowych trudno barwiących się
2. W zależności od czasu barwienia:
progresywne - stosowanie rozcieńczonych barwników przez długi okres czasu (12-24 godz.)
regresywne - stężone barwniki przez krótki okres czasu z następującym po nim odbarwieniu
3. W zależności od ilości zastosowanych barwników:
proste - obraz monochromatyczny, jednobarwny
- np. metoda Lӧfflera (błękit metylenowy)
złożone - obraz polichromatyczny, wielobarwny
- metoda Ziehl-Neslera (bakterie kwasooporne)
- metoda Giemzy (w przypadku riteksji)
- metoda Niessera (uwidacznia mat. zapas. np. u maczugowców)
Zjawisko metachromazji - powstające wskutek wybiórczego wybarwienia niektórych składników komórkowych w stosunku do pozostałych, np. błękit Lӧfflera barwi otoczkę laseczek wąglika na różowo, a komórka i tło barwi się na niebiesko.
Metoda Grama:
1. przygotować preparat trwały
2. nanieść fiolet krystaliczny 1-2min, spłukać wodą.
3. nanieść płyn Lugola 1-2 min., spłukać
4. nanieść alkohol 15s., spłukać
5. nanieść fuksynę zasadową 30s., spłukać
6. przetrzeć od dołu, odcisnąć bibułką od góry
7. olejek i pod 100x
W tej metodzie barwnikiem podstawowym jest fiolet krystaliczny, kontrastowym - fuksyna zasadowa, płyn Lugola jest utrwalaczem, a alkohol odbarwiaczem. Fiolet penetruje do wnętrza komórki, gdzie łączy się z jodem tworząc nierozpuszczalne fioletowe kompleksy (gruba warstwa mureiny zatrzymuje barwnik). Fuksyna uwidacznia te komórki.
- Gram- na fioletowo lub niebiesko (40 warstw mureiny, 50-90%)
- Gram+ na różowo lub czerwono (1-2 warstwy, 10%)
Barwniki zasadowe posiadają barwny kation i reagują ze strukturami naładowanymi ujemnie takimi jak: kw. nukleinowe, białka, kw. tejchojowe. Są to: błękit metylenowy, fuksyna, fiolet krystaliczny, safranina, zieleń malachitowa, fiolet metylowy, fiolet goryczki.
Barwniki kwaśne bają barwny anion i stosuje się je w barwieniu negatywnym (eozynian sodu, nigrozyna, tuz chiński, czerwień Kongo, cyjanochinina, kolargol).
Większość barwników jest zasadowa, bo bakterie mają gł. odczyny kwaśne - powinowactwo do przeciwnego odczynu.