ENZYMY
1. Enzymy - biokatalizatory - przyspieszają osiągnięcie stanu równowagi reakcji, których zajście z termodynamicznego punku widzenia jest możliwe. Uczestnicząc w przekształcaniu substratu w produkt same nie zużywają się w trakcie reakcji:
a/ znakomita większość znanych dziś enzymów to białka globularne, część z nich
wymaga współpracy z kofaktorami, którymi są drobnocząsteczkowe związki
organiczne mocno wiązane przez enzym - grupy prostetyczne (1), wiążące się z nim
przejściowo w toku reakcji i pełniące często rolę kosubstratów - koenzymy(2) a
także jony metali(3).
b/ w ostatnich dwudziestu latach odkryto, że niektóre kwasy rybonukleinowe mają
również właściwości katalityczne, nazwano je rybozymami, uczestniczą one jednak
tylko w szeroko pojętym procesie ekspresji genu, nie stwierdzono natomiast udziału
rybozymów w podstawowym metabolizmie, którego przebieg jak i forma życia jaką
znamy nie byłyby możliwe bez udziału typowych enzymów białkowych
c/ jednostki aktywności:
jednostki międzynarodowe (IU, U): 1U to aktywność wytwarzająca 1μmol produktu/min
katale: 1kat to aktywność wytwarzająca 1 mol produktu/s; 1katal=6•107 U, 1U=16.67 nKat
2. Cechy charakteryzujące enzymy jako katalizatory:
a/ sprawność (wydajność) katalityczna - zdolność przyspieszania rzędu 106 - 1012 razy, np. reakcja, która w obecności enzymu zwiększającego szybkość 108 razy biegnie 1s w jego nieobecności musiałaby trwać 108s to znaczy TRZY LATA!!!
b/ swoistość - może być względem substratu, względem reakcji lub względem reakcji i substratu; enzymy są znacznie bardziej selektywne niż jakiekolwiek inne katalizatory
c/ działanie w łagodnych warunkach - niskie ciśnienie, temperatura i zakres łagodnych wartości pH (2 - 8, większość aktywna w pH około 7); katalizatory wykonane przez człowieka wymagają często bardzo wysokich ciśnień, temperatur i stężeń H+ lub OH-
d/ aktywność może ulegać regulacji - istnieje szereg enzymów, które zmieniają aktywność stosownie do aktualnych potrzeb komórki czy organizmu pod wpływem czynników środowiskowych (zmiany jakościowe) lub zmienia się ilość enzymu (zmiany ilościowe)
3. Centrum aktywne, miejsce aktywne to ta część cząsteczki, która jest bezpośrednio zaangażowana w reakcji chemicznej. W przypadku prostych cząsteczek, takich jak np. kwasy nieorganiczne w reakcję zaangażowana jest cała cząsteczka. W przypadku dużych i złożonych cząsteczek, takich jak np. enzymy, polimery syntetyczne i niektóre rozbudowane związki metaloorganiczne tylko niewielka część cząsteczki jest rzeczywiście zaangażowana w reakcję a jej reszta pozostaje praktycznie bierna.
W białku centrum aktywne stanowi grupa aminokwasów, które leżą blisko siebie w trójwymiarowej cząsteczce, choć często są od siebie bardzo oddalone w sekwencji. Częstymi aminokwasami centrum aktywnego są aminokwasy zasadowe oraz kwasowe. Aminokwasy z niepolarnym (hydrofobowym) łańcuchem bocznym bardzo rzadko wchodzą w skład centrum aktywnego, ponieważ taki łańcuch boczny wchodzi w niewiele reakcji.
Aminokwasy wchodzące w skład centrum aktywnego są zazwyczaj ewolucyjnie bardziej stabilne niż aminokwasy na innych pozycjach, ponieważ zmiana aminokwasu w tej pozycji mogłaby uniemożliwić enzymowi katalizowanie dotychczasowej reakcji. W wielu enzymach niektóre z aminokwasów centrum aktywnego są identyczne nawet u bardzo słabo spokrewnionych organizmów.
W przypadku polimerów syntetycznych centrum aktywne znajduje się zazwyczaj na końcu cząsteczek, choć w przypadku syntezy polimerów gwiazdowych i dendrymerów centrum aktywne znajduje się najpierw w samym środku cząsteczki a potem ulega "rozmnożeniu" oddalając się jednocześnie od pierwotnego środka. W przypadku szczepionych natomiast centra aktywne są inicjowane w przypadkowych miejscach na łańcuchu głównym polimeru i następnie przenoszą się stopniowo wzdłuż narastających odgałęzień bocznych.
Oprócz enzymów z jednym centrum aktywnym mamy także enzymy allosteryczne. Są to związki mające więcej niż jedno miejsce aktywne, które to miejsca kooperatywnie wiążą cząsteczki substratu, dzięki czemu związanie substratu w jednym miejscu aktywnym indukuje w enzymie zmianę konformacyjną, zmieniającą powinowactwo do substratu w innych miejscach aktywnych. Ten typ enzymów może występować w formie białka złożonego z wielu podjednostek, z których każda ma miejsce aktywne. Poza tym enzymy allosteryczne mogą być kontrolowane przez cząsteczki efektorowe (aktywatory i inhibitory), które wiążą się do innych miejsc niż miejsca aktywne i zmieniają szybkość aktywności enzymatycznej
4. Enzymy - tworzenie kompleksu enzymu z substratem, ES: tak wielką sprawność, wydajność katalityczną enzymy uzyskują dzięki tworzeniu przejściowego połączenia z substratem tzw. kompleksu ES; pozwala to na pokonanie barier termodynamicznych i fizykochemicznych utrudniających zajście reakcji a mianowicie:
a/ rozproszenia i ruchliwości cząsteczek substratów oraz znacznej przypadkowości
zderzeń w sensie kontaktu reaktywnych ugrupowań substratów (niska efektywność
zderzeń) - enzym „porządkuje” stan substratu(ów) pokonując te efekty entropowe
b/ uwodnienia substratu co w przypadku reakcji biegnących w środowisku wodnym jest
zjawiskiem powszechnym - enzym lokując substrat(y) w obszarze o charakterze
hydrofobowym pozbawia go(je) płaszcza wodnego odsłaniając na działanie swoich
aktywnych grup
c/ stabilności utrwalonej struktury substratu - enzym wytwarza w substracie napięcia,
naprężenia, odkształcenia co powoduje labilizację, osłabienie wiązań, które mają
ulec zerwaniu
5. Enzym wiąże się z substratem w kompleks ES w wyniku zaistnienia wielu odwracalnych, słabych oddziaływań rzędu ułamków do kilku kilokalorii wywołując efekt energetyczny, energię wiązania ES wielkości kilku do kilkunastu kilokalorii; część tej energii, uwalnianej w trakcie tworzenia ES wykorzystywana jest np. do wywołania naprężeń, napięć w substracie służąc w ten sposób m.in. zmniejszeniu energii aktywacji danej reakcji (obliczenie oparte na zależności podanej w punkcie 2b pozwala wykazać, ze obniżenie aktywacji o 15-20 kcal/mol zwiększa stałą szybkości reakcji (k) a tym samym szybkość reakcji (v) ~1014 razy!). Mechanizm działania enzymów polega na stworzeniu z określonym związkiem chemicznym nietrwałego połączenia, w trakcie którego następuje rozłożenie substancji chemicznej do substancji prostej i wchłoniecie jej przez komórkę oraz uwolnienie substancji enzymatycznych.
6. Enzym - centrum aktywne - kompleks ES tworzy się przez przyłączenie substratu do wyróżnionego miejsca w strukturze enzymu określanego jako miejsce aktywne, które charakteryzuje się następującymi własnościami:
a/ obejmuje niewielką część całkowitej objętości enzymu
b/ jest trójwymiarową strukturą, którą często tworzą bardzo odległe sekwencyjnie aminokwasy (np. chymotrypsyna)
istnieją centra aktywne jakby przygotowane na przyjęcie danego substratu - aprioryczne dopasowanie (np. lizozym, chymotrypsyna)
centra aktywne innych enzymów tworzą się w trakcie wiązania substratu - indukowane dopasowanie (np. karboksypeptydaza A)
c/ stanowi zagłębienie w strukturze enzymu (niszę, szczelinę, kieszeń) dzięki czemu otoczenie wiązanego substratu ma charakter hydrofobowy i jest mniej lub bardziej izolowane od wody
d/ substrat wiązany jest poprzez wiele oddziaływań nie kowalencyjnych jak hydrofobowe, jonowe, wodorowe czy van der Waalsa a swoistość wiązania substratu uzależniona jest w efekcie od precyzyjnego ułożenia i dopasowania wielu atomów centrum aktywnego i substratu
e/ w jego skład wchodzą:
aminokwasy odpowiedzialne za związanie substratu, określające tym samym swoistość substratową (1-szy etap procesu katalizy) oraz
aminokwasy uczestniczące w katalizie, tzw. centra katalityczne określające swoistość reakcji (2-gi etap procesu katalizy)
7. Kontrola aktywności enzymów występująca w organizmie:
a/ zwiększenie lub zmniejszenie efektywności ekspresji genu(ów) kodującego(ych) enzym - synteza enzymu lub jej zahamowanie (zmiana ilości enzymu)
b/ aktywacja zymogenowa - aktywacja enzymu syntetyzowanego i występującego w postaci nieaktywnego proenzymu (zymogenu); dotyczy m.in. enzymów proteolitycznych przewodu pokarmowego jak pepsynogen (pepsyna), trypsynogen (trypsyna), chymotrypsynogen (chymotrypsyna), proelastaza (elastaza) czy kaskady krzepnięcia krwi (protrombina -trombina) i polega na usunięciu różnej długości fragmentów łańcuchów polipeptydowych tych proenzymów
c/ regulacja aktywności enzymów allosterycznych poprzez efektory allosteryczne, których stężenia zmieniają się w trakcie przemian zachodzących w organizmie
d/ modyfikacja kowalencyjna - regulacja aktywności enzymu występującego w komórce poprzez odwracalne, kowalencyjne przyłączanie do łańcuchów bocznych niektórych aminokwasów czynnika modyfikującego: głównie jest to fosforylacja grup hydroksylowych seryn, treonin lub tyrozyn ale także pierścienia imidazolowego histydyny
8. Hamowanie aktywności enzymów czynnikami (inhibitory) nie będącymi naturalnymi składnikami środowiska katalizowanych przez nie reakcji:
a/ inhibicja nieodwracalna - najczęściej kowalencyjna modyfikacja łańcuchów bocznych aminokwasów centrum aktywnego lub katalitycznego, organizm nie posiada enzymów, które mogłyby rozciąć tak powstałe wiązanie, stąd nosi ono charakter trwałego i wyłącza zmodyfikowane cząsteczki enzymu z udziału w katalizie
- aspiryna (kwas acetylosalicylowy) acetyluje serynę (via grupa -OH) centrum aktywnego cyklooksygenazy i wpływa w ten sposób na przemiany kwasu arachidonowego i syntezę związków uczestniczących i towarzyszących szeroko rozumianemu procesowi zapalnemu
- DFP (diizopropylofluorofosforan) i inne halogenopochodne związków fosforoorganicznych (np. sarin - gaz bojowy czy liczne pestycydy) reagują z grupą -OH seryny centrum aktywnego wielu hydrolaz jak np. acetylocholinesterazy, enzymu odpowiedzialnego za hydrolizę acetylocholiny, zahamowanie jego aktywności powoduje utrzymujące się pobudzenie cholinergicznych zakończeń nerwowych; podobne pochodne siarczanów organicznych jak PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu) reagują z grupami - OH reszt seryn licznych proteaz serynowych jak np. trypsyna
- jodooctan lub amid kwasu jodooctowego reagują z grupami -SH łańcuchów bocznych cystein obecnych w centrum aktywnym wielu enzymów; podobną reaktywność wykazują jony metali ciężkich jak rtęci czy ołowiu (Hg+2, Pb+2)
- penicylina należy do inhibitorów przypominających działanie tzw. ”substratów samobójców”- modyfikuje kowalencyjnie centrum aktywne peptydylotransferazy glikopeptydów, której aktywność jest niezbędna licznym szczepom bakterii dla budowania szczelnych ścian komórkowych; penicylina jako analog ”stanu przejściowego” wiąże się efektywnie z centrum aktywnym tego enzymu i tworzy estrowe połączenie z łańcuchem bocznym obecnej tam seryny nie dopuszczając do budowania przez bakterie zabezpieczających je ścian komórkowych
b/ inhibicja odwracalna - przejściowe, odwracalne wiązanie inhibitorów co prowadzi do czasowego wyłączenia cząsteczek enzymów wiążących inhibitor z udziału w katalizie
•hamowanie kompetycyjne - inhibitor wykazuje strukturalne podobieństwo do substratu i konkuruje, współzawodniczy z nim o związanie się w centrum aktywnym (E): wytworzenie kompleksu z inhibitorem (EI) wyłącza enzymu z udziału w katalizie ale wzrost stężenia substratu usuwa efekt działania inhibitora - [S] vo , VImax = Vmax , KIm = Km•(1+ [I]/Ki) ; analiza wykresów obrazujących zależność v od [S] i 1/v od 1/[S];
poszukiwania inhibitorów kompetycyjnych znajdują się w centrum
zainteresowania nauk biomedycznych (na przykład metotreksat i amino-
pteryny jako inhibitory przemian kwasu foliowego i syntezy DNA w leczeniu
nowotworów, azaseryna jako analog kwasu glutaminowego i sulfonamidy
jako analogi kwasu p-aminobenzoesowego stosowane w zwalczaniu infekcji
bakteryjnych poprzez blokowanie syntezy kwasu foliowego)
•hamowanie niekompetycyjne (klasyczne) - inhibitor nie wykazuje podobieństwa do substratu i łączy się zarówno z samym enzymem (EI) jak i z kompleksem enzym-substrat (IES) w innym niż substrat miejscu powodując w obu przypadkach wyłączenie enzymu z udziału w katalizie, spadek jego aktywności (szybkości maksymalnej), w tym wypadku wzrost stężenia substratu nie wpływa na efekt działania inhibitora - [S] vo , KIm = Km , VImax = Vmax/(1+ [I]/Ki); analiza wykresów obrazujących zależność v od [S] i 1/v od 1/[S]
•hamowanie akompetycyjne - inhibitor nie wykazuje podobieństwa do substratu a łączy się tylko z kompleksem enzym-substrat (IES) w innym niż substrat miejscu powodując wyłączenie enzymu z udziału w katalizie, spadkowi aktywności enzymu (szybkości maksymalnej) towarzyszy spadek Km co najczęściej tłumaczone jest zmniejszonym oddysocjowywaniem substratu pod wpływem inhibitora, w tym wypadku wzrost stężenia substratu zmniejsza szybkość reakcji - [S] vo , VImax = Vmax/(1 + [I]/Ki), KIm = Km/(1+ [I]/Ki); z tym typem hamowania mamy głównie do czynienia w reakcjach wielosubstratowych; analiza wykresów obrazujących zależność v od [S] i 1/v od 1/[S]
9. Klasyfikacja enzymów z uwzględnieniem koenzymów (grup prostetycznych):
a/ oksydoreduktazy - Aoks + Bred Ared + Boks - reakcje utleniania-redukcji
•dehydrogenazy - AH2 + NAD+ (FAD) A + NADH + H+ (FADH2) koenzymy: NAD+, rzadziej NADP+ - pochodne niacyny, witaminy PP (B3) FAD, rzadziej FMN - pochodne ryboflawiny, witaminy B2 (przykłady - dehydrogenaza mleczanowa i bursztynianowa oraz mechanizmy przenoszenia elektronów z udziałem tych koenzymów) DPT (difosfotiamina) - pochodna tiaminy, witaminy B1 , która wraz z liponianem są niezbędnym elementem funkcjonalnym dehydrogenaz α- ketokwasów (pirogronian, α-ketoglutaran i inne pochodne aminokwasów)
•oksydazy - AH2 + O2 A + H2O2 ; koenzymy: FAD, FMN (przykłady - oksydaza glukozy, oksydazy L- i D-aminokwasów)
•oksygenazy:
- dioksygenazy - AH2 + O2 A(OH) 2 (niezbyt często występujące)
- monooksygenazy - AH + O2 + NADP+ A(OH) + H2O + NAPDH (hydroksylazy); koenzymem obok NADPH + H+ jest hem (cytochrom P450, wiele reakcji przemian steroidów; procesy detoksykacji) a także witamina C (np. reakcja hydroksylacji proliny w trakcie syntezy kolagenu - hydroksylaza proliny)
•peroksydazy - AH2 + H2O2 A + 2H2O ; koenzym - hem (przykład - peroksydaza glutationowa: 2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O; enzym z selenocysteiną, uczestniczy w procesach usuwania reaktywnych form tlenu)
•katalaza - H2O2 + H2O2 O2 + 2H2O; koenzym - hem (ważny enzym uczestniczący w procesach usuwania reaktywnych form tlenu)
b/ transferazy - A-B + C A + B-C - reakcje przenoszenia fragmentów substratów
przykładem transferaz są kinazy, enzymy przenoszące resztę fosforanową (-P), której
najczęstszym donorem (kosubstratem) jest ATP- adenozynotrifosoforan: gluko- lub
heksokinaza katalizują reakcję: glukoza + ATP glukozo-6-P + ADP koenzymy: DPT (difosfotiamina) - pochodna tiaminy, witaminy B1 (transketolazy) PLP( fosforan pirydoksalu) - pochodna pirydoksaminy, witaminy B6 (aminotransferazy) KoA (koenzym A) - pochodna kwasu pantoteinowego, witaminy B5 (przenoszenie reszt acetylowych - CO(CH3) i acylowych - CO(R)) THF (tetrahydrofolian) - pochodna kwasu foliowego (przenoszenie licznych tzw. fragmentów jednowęglowych) metylokobalamina - pochodna cyjankobalaminy, witaminy B12 (metylotransferaza homocysteinowa)
c/ hydrolazy - A-B + H2O A-H + B-OH - reakcje hydrolitycznego rozczepienia substratów: np. proteinazy i peptydazy - hydroliza wiązania peptydowego białek i peptydów (chymotrypsyna, trypsyna, kolagenazy i inne); glikozydazy - hydroliza wiązania glikozydowego oligo- i polisacharydów (przykładem jest lizozym); esterazy jak choćby fosfatazy - glukozo-6-P + H2O glukoza + Pi (fosfataza glukozo-6-P), nukleazy - hydroliza wiązań fosfodiestrowych w DNA i RNA czy lipazy - hydroliza
wiązań estrowych estrów kwasów karboksylowych
d/ liazy - A-B A + B - reakcje rozczepienia lub tworzenia wiązań na innej drodze niż hydroliza czy reakcje redoks przykładem liaz są: dehydrataza węglanowa (Zn+2) - H2O + CO2 HCO3 + H+ czy dekarboksylaza pirogronianowa, której koenzymem jest DPT (difosfotiamina) a także liczne dekarboksylazy współpracujące z PLP (fosforanem pirydoksalu) jako koenzymem
e/ izomerazy - A izo-A - reakcje przekształcenia substratu w jego izomer przykładem może być izomeraza fosfotrioz katalizująca reakcje: aldehyd-3-fosfoglicerynowy fosfodihydroksyaceton a także mutaza metylomalonylo-KoA współpracująca z deoksyadenozylokobalaminą jako koenzymem (pochodna witaminy B12)
f/ ligazy - A + B + ATP A-B + ADP + Pi - reakcje łączenia substratów (tworzenia
wiązań) w sprzężeniu z hydrolizy związku ”wysokoenergetycznego) przykładem ligaz (zwanych czasami syntetazami) są karboksylazy współpracujące często z biotyną jako koenzymem, jak choćby karboksylaza pirogronianowa: pirogronian + CO2 + ATP szczawiooctan + ADP + Pi