Techniki fluorescencyjne w analizie związków biologicznie czynnych
Większa selektywność i specyficzność analiz
Bardzo niska granica oznaczalności ( ilość związku)
Bardzo niska granica wykrywalności ppb ppt 10 -12g (pg)
Czułość - reakcja danej metody na zmianę ilości związku (substancji) - generuje się duża zmiana w emisji- 3-6 razy większa niż w absorpcjometrii
Fluorofor jest częścią cząsteczki, która odpowiada za jej fluorescencję. Najczęściej jest to grupa funkcyjna, zdolna do absorpcji energii o określonej długości fali, a później do wyemitowania innej długości fali (ściśle określonej). Ilość energii oraz długość fali emitowanej zależy od właściwości fluoroforu, ale również od środowiska chemicznego w jakim on działa (np. pH, czy siła jonowa). Stosuje się zestawy fluoroforów.
Fluorofory jako znaczniki |
Ex |
Em |
Hydroksykumaryna Izotiocyjanian fluoresceiny(FITC) Tetrametylorodamina (TRITC) Indokarbocyjanina (Cy5) |
325 495 547 625-650 |
386 519 572 670 |
Fluorofory wiążące się z kwasami nukleinowymi |
Ex |
Em |
|
Hoechst 33342 SYTOX Green Chromomycin A3 Arcidine Orange Dapi |
343 504 445 503 345 |
483 523 573 530-640 465 |
AT-selektywny DNA CG-selektywny DNA i RNA AT-selektywny |
Znaczniki fluorescencyjne- syntetyczne barwniki fluorescencyjne (fluorofory), charakteryzujące się dużą wydajnością kwantową fluorescencji, które wykazują reaktywność względem określonych grup (aminowej, tiolowej). Daje to możliwość znakowania niefluoryzujących związków (leków, białek, DNA) w celu ich detekcji i oznaczenia technikami fluorescencyjnymi.
Sondy fluorescencyjne:
Jest fluoroforem, który lokalizuje się w specyficznym rejonie biologicznego obiektu (np. błony komórkowe, mitochondria, jądro) lub odpowiada na specyficzny czynnik stymulujący
Sondy mogą lokalizować się w określonym regionie komórki (np. błony komórkowe, mitochondria, jądra) lub wiązać się do określonych sekwencji wyizolowanego DNA (np. podczas procesu sekwencjonowania lub hybrydyzacji DNA)
Mogą odpowiadać na działanie specyficznych enzymów
Rolę sony mogą pełnić:
znaczniki fluorescencyjne charakteryzujące się wysoką wydajnością kwantową fluorescencji np. ANS (anilino-naftaleno-sulfonian), TNS (tolueno-naftaleno-sulfonian) czy chlorek dansylu
fluoryzujące barwniki związane z oligonukleotydami np. sondy hybrydyzacyjne do ilościowego PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym)
fluoryzujące barwniki związane z przeciwciałami np. sondy immunofluorescencyjne, pozwalające wykrywać odpowiednie antygeny (np. na pow. nowotworów)
słabo fluoryzujące barwniki, które stają się fluoroforami (FRET technika) o wysokiej wydajności kwantowej ф, dopiero wtedy gdy zwiąże się z określoną docelową molekułą.
niefluoryzujące barwniki przekształcone w fluoryzujący produkt na drodze enzymatycznej (bardzo czuła metoda oznaczania aktywności enzymatycznej)
związki wchodzące w skład żywych organizmów; tryptofan (wykorzystywany najczęściej, Eex295nm, Eem305nm), tyrozyna, fenyloalanina, porfiny, FAD, NAD
Szczególny rodzaj sond luminescencyjnych - fluorescencyjne sondy molekularne:
Stanowią one fragment genomowego DNA rozpoznający sekwencje różniące się zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzą trwałe wiązania z komplementarnymi fragmentami kwasów nukleinowych, zawierają dołączone fluorofory. Pozwalają na wykrywanie mutacji genowych, polimorfizmów.
Sonda typu „molecular bacon” - boja- latarnia molekularna
Sonda; cel sondy
Sonda z jednoniciowego DNA (ssDNA) ukształtowana w postać szpilki do włosów (oligonukleotyd zawierający grupę fluoroforu i grupę wygaszacza). Fluorescencja ma miejsce dopiero wtedy, gdy sonda przyłączy się do kwasu nukleinowego będącego jej celem.
Fluorescencyjny rezonansowy transfer FRET- fluorescencyjne rezonansowe przeniesienie energii (fluorescence resonance energy transfer)- metoda opiera się na istnieniu bezpromienistego (bez fotonu) transferu energii między wzbudzonym donorem a niewzbudzonym akceptorem, którymi są sondy fluorescencyjne.
D* + A D + A* D-donor
A* A + hυ A-akceptor
Warunek konieczny do transferu:
widmo absorpcyjne musi pokrywać się z widmem emisji donora (opt.~30%)
odpowiednie ułożenie dipoli pary donor-akceptor
odległość między nimi rzędu 1-10nm
Jeśli selektywnie wzbudzony donor to obserwujemy spadek pochodzący od donora fluorescencji, wzrost dla akceptora.
Typowe pary donor-akceptor to np.:
Fluoresceina-fluoresceina
Tetrametylorodamina-fluoresceina
Przykłady użycia:
Badanie oddziaływań antygen-przeciwciało
Wiązanie substratu przez enzym
Zastosowanie:
Badanie oddziaływań par enzym-substrat lub antygen-przeciwciało
Badanie procesów fałdowania i rozwijania białek
Śledzenie asocjacji podjednostek białka czy fragmentów DNA o komplementarnej sekwencji zasad
Monitorowanie powstawania kompleksów białko-białko, białko-DNA
Określanie wpływu białka na DNA
Przyrządy stosowane w technikach fluorescencyjnych:
spektrofluorymetry
czytniki mikropłytek- mierzy fluorescencję płytek
cytometry przepływowe- określa fluorescencję znakowanych fluoroforem żywych komórek lub mikrocząsteczek np. limfocytów, neutrofili, monocytów.
mikroskopy fluorescencyjne - do obserwacji w skali mikro, identyfikacja fluoroforów obecnych na powierzchni lub wnętrzu żywych komórek.
aparaty do elektroforezy kapilarnej (białka, DNA - do ich rozdziału)
sekwenatory DNA
skanery fluorescencyjne - do badania fluorescencji obiektów makroskopowych w płytkach DNA/proteina (tzw. chip), żelach do elektroforezy, chromatografach w chromatografii cienkowarstwowej. Stosowany w oznaczeniach ilościowych protein i kwasów nukleinowych (porównanie z paskami o znanym stężeniu)
Zastosowanie sond fluorescencyjnych:
analiza ekspresji genów mRNA (mikromacierz)
detekcja i oznaczanie białek, DNA, RNA
analiza przeżywalności komórek
badanie proliferacji
detekcja stresu oksydacyjnego (zaburzenia cyklu tlenu - tlenek azotu)
analiza aktywności enzymów
analiza struktury błon komórkowych (ich integralność)
jako indykatory pH (np. w kompartmentach komórkowych)
Subkomórkowa struktura komórek śródbłonka widoczna przy użyciu 3 sond fluorescencyjnych
Fluorescencja niebieska- jądrowa
Fluorescencja czerwona - mitochondrium
Fluoresceina zielona- aktyna filamentów
Stadia mitozy- mikrotubule-zielone, chromosomy-niebieskie
Nieuszkodzone żywe komórki - zielona
Uszkodzone żywe komórki - czerwona
Przechodzący przez błony barwnik znakuje kwasy nukleinowe nieuszkodzonych komórek (zielona fluorescencja)
Detekcja stresu oksydacyjnego
Pochodna fluoresceiny fluoryzuje na zielono utlenieniu przez ROS (rodniki) po utlenieniu przez reaktywne formy tlenu. Komórki nie poddane stresowi - brak fluorescencji, znikoma fluorescencja.
Detekcja anionu ponadtlenowego w mitochondriach- indykator fluoryzuje na czerwono po utlenieniu przez anion ponadtlenkowy. Jądra wybarwiono barwnikiem Hoechst 3342 fluoryzującym na niebiesko po związaniu do kwasów nukleinowych.
Immunocytochemia - wykorzystująca reakcje antygenu wyznakowane fluoresceiną- przeciwciała, umożliwia identyfikacje całej gamy patologicznych mikroorganizmów- wirus HIV, Herpes, ospy, grzyby.
Komórki nowotworowe osteosarcoma- ludzkiego
A - linia komórkowa prawidłowa ( szereg „dziki”)
B- linia komórkowa 60 (pozbawiona mitochondrialnego DNA)
Widoczne różnice w strukturze sieci mitochondrialnej.
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ FISH
Pozwala na wykrywanie specyficznych sekwencji DNA i RNA w chromosomach i na identyfikację aberracji chromosomowych.
Fluorofor (fluoresceina, adenina, czerwień toskańska) wbudowuje się w nić DNA i uwidacznia w określonym miejscu chromosomu. (Hybrydyzacja: wzajemne oddziaływanie między badanym fragmentem kwasu nukleinowego a sondą molekularną -prowadzi to do powstania hybrydy (dupleksu))
Badanie ekspresji genów na poziomie fragmentacji (mRNA) umożliwia ocenę ekspresji setek genów (nawet tysięcy). Pozwala na porównanie ekspresji w stanach fizjologicznych i patologicznych (mikromacierz cDNA)
Makromacierz cDNA- umożliwia ocenę ekspresji setek genów, pozwala na porównanie ekspresji w stanach fizjologicznych i patologicznych
FITC- znakuje przeciwciała monoklonalne związane ze ścianą
Zielone białko fluoryzujące GFP (ang. green fluorescent protein):
Białko wykazuje naturalną fluorescencję w obszarze widzialnym(ၬwz = 385 nm, ၬem = 508 nm), pochodzące z meduzy Aequorea Victoria
Gen GFP ulega ekspresji w komórkach bakterii, drożdży, roślin i ssaków co powoduje, że jest użytecznym narzędziem biologii molekularnej, doczepione do innych białek(seryna, tyrozyna, glicyna) zachowuje swoje fluoryzujące właściwości,
Białko GFP odkryto w latach 60-tych natomiast gen poznano w 1992 roku.
W 2008 roku odkrywcom i badaczom GFP, Martinowi Chalfiemu, Osamu Shimomurze i Rogerowi Tsienowi została przyznana Nagroda Nobla z chemii .
Struktura przestrzenna GFP- Na chromofor składają się 3 aminokwasy (seryna, tyrozyna, glicyna), które w otaczającym je środowisku ulegają cyklizacji i dehydratacji, co prowadzi do powstania fluoryzującego układu sprzężonych wiązań podwójnych.
Zastosowanie GFP:
do oceny skuteczności transfekacji
jako gen reporterowy w badaniach aktywności promotorów i poziomu ekspresji genów znajdujących się pod ich kontrolą.
do śledzenia interakcji pomiędzy białkami praz lokalizacji badanego białka w komórce (białka fuzyjne złożone z GFP interesującego nas białka)
Mutanty GFP- wprowadzenie mutacji do GFP pozwoliło otrzymać białka, które wykazują zwiększoną fluorescencję (EGFP; ang. enhanced GFP) i zmianę długości emitowanego światła.
Powstały białka świecące na:
niebiesko (BFP ; ang. blue fluorescent protein)
czerwono, wiśniowo (RFP; ang. red fluorescent protein)
żółto (YFP; ang. yellow fluorescent protein)
Przykłady: komórka Hela (komórki raka szyjki macicy)
Przykłady oznaczeń:
hormony (adrenalina, noradrenalina)
witaminy (tiamina, ryboflawina)
aminokwasy
kwas foliowy
cholesterol
histamina
fenyloamina
środki farmaceutyczne ( antybiotyki, witaminy syntetyczne- barbiturany, aflatoksyny, testy wrażliwości na antybiotyki -aspiryna, chloropromucyna, morfina- toksykologia.)
środki żywnościowe ( tłuszcze, węglowodany, cukry proste, zafałszowania win - sacharyna)
związki nieorganiczne ( kation Al., Be, Ca, Ga, pierwiastki ziem rzadkich)
środowiskowe ( stopień czystości wody - olej, zanieczyszczenia gleby, algi, bakteriologiczne E. Coli)