Techniki Fluorescencji w Analizie instrumentalnej, Analityka medyczna, Analiza instrumentalna


Techniki fluorescencyjne w analizie związków biologicznie czynnych

Fluorofor jest częścią cząsteczki, która odpowiada za jej fluorescencję. Najczęściej jest to grupa funkcyjna, zdolna do absorpcji energii o określonej długości fali, a później do wyemitowania innej długości fali (ściśle określonej). Ilość energii oraz długość fali emitowanej zależy od właściwości fluoroforu, ale również od środowiska chemicznego w jakim on działa (np. pH, czy siła jonowa). Stosuje się zestawy fluoroforów.

Fluorofory jako znaczniki

Ex

Em

Hydroksykumaryna

Izotiocyjanian fluoresceiny(FITC)

Tetrametylorodamina (TRITC)

Indokarbocyjanina (Cy5)

325

495

547

625-650

386

519

572

670

Fluorofory wiążące się z kwasami nukleinowymi

Ex

Em

Hoechst 33342

SYTOX Green

Chromomycin A3

Arcidine Orange

Dapi

343

504

445

503

345

483

523

573

530-640

465

AT-selektywny

DNA

CG-selektywny

DNA i RNA

AT-selektywny

Znaczniki fluorescencyjne- syntetyczne barwniki fluorescencyjne (fluorofory), charakteryzujące się dużą wydajnością kwantową fluorescencji, które wykazują reaktywność względem określonych grup (aminowej, tiolowej). Daje to możliwość znakowania niefluoryzujących związków (leków, białek, DNA) w celu ich detekcji i oznaczenia technikami fluorescencyjnymi.

Sondy fluorescencyjne:

Rolę sony mogą pełnić:

Szczególny rodzaj sond luminescencyjnych - fluorescencyjne sondy molekularne:

Stanowią one fragment genomowego DNA rozpoznający sekwencje różniące się zaledwie kilkoma nukleotydami i tworzą trwałe wiązania z komplementarnymi fragmentami kwasów nukleinowych, zawierają dołączone fluorofory. Pozwalają na wykrywanie mutacji genowych, polimorfizmów.

Sonda typu „molecular bacon” - boja- latarnia molekularna

0x01 graphic

Sonda; cel sondy

Sonda z jednoniciowego DNA (ssDNA) ukształtowana w postać szpilki do włosów (oligonukleotyd zawierający grupę fluoroforu i grupę wygaszacza). Fluorescencja ma miejsce dopiero wtedy, gdy sonda przyłączy się do kwasu nukleinowego będącego jej celem.

Fluorescencyjny rezonansowy transfer FRET- fluorescencyjne rezonansowe przeniesienie energii (fluorescence resonance energy transfer)- metoda opiera się na istnieniu bezpromienistego (bez fotonu) transferu energii między wzbudzonym donorem a niewzbudzonym akceptorem, którymi są sondy fluorescencyjne.

D* + A D + A* D-donor

A* A + hυ A-akceptor

Warunek konieczny do transferu:

Jeśli selektywnie wzbudzony donor to obserwujemy spadek pochodzący od donora fluorescencji, wzrost dla akceptora.

Typowe pary donor-akceptor to np.:

Przykłady użycia:

  1. Badanie oddziaływań antygen-przeciwciało

  2. Wiązanie substratu przez enzym

Zastosowanie:

Przyrządy stosowane w technikach fluorescencyjnych:

Zastosowanie sond fluorescencyjnych:

Subkomórkowa struktura komórek śródbłonka widoczna przy użyciu 3 sond fluorescencyjnych

Detekcja stresu oksydacyjnego

Immunocytochemia - wykorzystująca reakcje antygenu wyznakowane fluoresceiną- przeciwciała, umożliwia identyfikacje całej gamy patologicznych mikroorganizmów- wirus HIV, Herpes, ospy, grzyby.

Komórki nowotworowe osteosarcoma- ludzkiego

A - linia komórkowa prawidłowa ( szereg „dziki”)

B- linia komórkowa 60 (pozbawiona mitochondrialnego DNA)

Widoczne różnice w strukturze sieci mitochondrialnej.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ FISH

Zielone białko fluoryzujące GFP (ang. green fluorescent protein):

Zastosowanie GFP:

Mutanty GFP- wprowadzenie mutacji do GFP pozwoliło otrzymać białka, które wykazują zwiększoną fluorescencję (EGFP; ang. enhanced GFP) i zmianę długości emitowanego światła.

Powstały białka świecące na:

Przykłady: komórka Hela (komórki raka szyjki macicy)

Przykłady oznaczeń:



Wyszukiwarka