Chromatografia cienkowarstwowa - Thin Layer Chromatography (TLC) ─ podstawy metody.

Chromatografia cienkowarstwowa jest szybką i wygodną metodą jakościowego badania składu mieszanin substancji oraz ilościowego oznaczania zawartości poszczególnych składników. Zastosowanie znajduje przede wszystkim dla związków organicznych. Metodę tę stosuje się przy śledzeniu postępu i kierunku reakcji między związkami organicznymi, w analizie mieszanin: poreakcyjnych i uzyskiwanych z surowców naturalnych, przy potwierdzaniu identyczności składników produktów handlowych (leki, barwniki, środki konserwujące itp.), a także przy badaniu obecności wszelkiego rodzaju zanieczyszczeń np. w produktach spożywczych i
w środowisku naturalnym.

Metoda chromatografii (m. in. cienkowarstwowej i kolumnowej) oparta jest na zjawisku występowania specyficznych oddziaływań między substancjami chemicznymi a fazą stacjonarną, zwaną nośnikiem, którą mogą stanowić np. sorbenty: tlenek glinu Al₂ O₃ lub żel krzemionkowy. Oddziaływania te, wynikające np. z adsorpcji, podziału między dwie fazy lub wymiany jonowej, zależą od oddziaływań grup funkcyjnych obecnych w danej cząsteczce związku organicznego, z fazą stacjonarną. W przypadku związków chiralnych i faz stacjonarnych optycznie czynnych oddziaływania te zależą także od budowy przestrzennej składników mieszaniny.

Zasada rozdziału TLC. Na płytkę chromatograficzną, pokrytą odpowiednio dobraną fazą stacjonarną, stanowiącą cienką jednolitą warstwę na szklanym, plastikowym lub aluminiowym podłożu, nanosi się w punkcie startu mieszaninę substancji. Składniki mieszaniny oddziaływują z nośnikiem i zostają przez niego związane z różną siłą. Płytkę umieszcza się następnie w komorze chromatograficznej w której znajduje się faza ruchoma ― odpowiednio dobrany rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników. Faza ruchoma zwilżając sorbent tworzy z nim układ dwufazowy. W każdym fragmencie rozwijanego w ten sposób chromatogramu ustala się stan równowagi, zależny dla każdego ze składników od jego powinowactwa do obu faz. Składniki rozdzielanej mieszaniny o większym powinowactwie do fazy ruchomej rozpuszczają się w niej w większym stopniu i wraz z nią są przenoszone na nową porcję sorbentu. W wyniku ustalania się szeregu kolejnych stanów równowagi substancje słabiej związane z fazą stacjonarną „przewędrują” wraz z rozpuszczalnikiem dłuższą drogę, niż substancje związane słabiej. Miarą przebytej drogi jest tzw. współczynnik R_f substancji. W określonych warunkach identyczne substancje będą się zachowywać tak samo i „odbędą” taką samą drogę na fazie stacjonarnej (= wzdłuż płytki chromatograficznej).

Wartość współczynnika R_f = A/B

Rozwinięty chromatogram cienkowarstwowy jest przedstawiony na rysunku:

Linia startu

B linia mety

A

Każdą substancję charakteryzuje wartość współczynnika określanego symbolem Rf , definiującego położenie plamy substancji badanej (X) względem punktów: początkowego (start) i końcowego (meta) na rozwiniętym chromatogramie. A ― odległość od startu do środka plamy

B ― odległość od startu do mety

Wartość współczynnika Rf dla danej substancji jest stała w ściśle określonych warunkach.

Wykonanie chromatogramu. Analizę chromatograficzną metodą TLC wykonuje się
w komorach chromatograficznych nasyconych parami rozpuszczalnika. Na płytkę chromatograficzną z zaznaczoną ołówkiem linią startu nanosi się roztwór badanej mieszaniny i substancji wzorcowych, a następnie po wysuszeniu resztek rozpuszczalnika z płytki umieszcza się ją pionowo w komorze z rozpuszczalnikiem (ok. 0,5 cm od dna komory). Rozpuszczalnik wsiąka w płytkę dzięki zjawisku włoskowatości i powoduje stopniowe "uwalnianie" i przesuwanie substancji wzdłuż płytki. Po osiągnięciu przez front rozpuszczalnika górnej krawędzi płytki, chromatogram uważa się za rozwinięty. Płytkę wyjmuje się wtedy z komory, zaznacza ołówkiem górną linię (mety), a płytkę suszy strumieniem powietrza.

Wywoływanie chromatogramu. Końcowym etapem analizy jest wywoływanie chromatogramu, tzn. taka jego obróbka, która powoduje ujawnienie się miejsc na płytce, gdzie znajdują się poszczególne składniki mieszaniny przesunięte wzdłuż płytki na skutek trójstronnych oddziaływań:

substancja ↔ sorbent ↔ rozpuszczalnik.

(Żargonowo nazywa się te miejsca "plamami substancji").

Uniwersalnym wywoływaczem dla chromatogramów cienkowarstwowych są pary jodu lub stęż. kwas siarkowy powodujący po ogrzaniu płytki zwęglenie wszystkich substancji organicznych
i ujawnienie się substancji w postaci czarnych plam. Dla nośników chromatograficznych wyposażonych dodatkowo w substancję fluoryzującą w świetle UV (np. SiO2 /F254) uwidocznienie plam na chromatogramie następuje po naświetleniu lampą UV emitującą fale o długości 254 nm. Dla bardzo wielu grup substancji organicznych zawierających grupy funkcyjne o wyraźnym charakterze chemicznym opracowano wiele specyficznych wywoływaczy chromatograficznych np. odczynnik Dragendorffa dla alkaloidów, wywoływacz cerowo-amonowy dla amin, ninhydrynowy dla aminokwasów i inne.

Dobór układu rozwijającego. W celu dobrania układu rozwijającego o odpowiedniej mocy eluującej dla danej mieszaniny substancji, należy wykonać szereg prób rozdziału chromatograficznego kolejno w kilku mieszaninach o różnej polarności, np. w benzenie, eterze etylowym, octanie etylu, chloroformie, acetonie, mieszaninie chloroformu z acetonem w stosunku 1 : 1. Najkorzystniejszy dla danej substancji jest taki układ rozpuszczalników, w którym wartość współczynnika Rf wynosi ok. 0,5. Aby upewnić się o jednorodności substancji, należy stwierdzić brak rozdziału na chromatogramie w 8 - 10 układach rozwijających i na przynajmniej dwóch nośnikach.

Zgodnie z wzrastającą polarnością rozpuszczalniki uszeregowano w tzw. szereg eluotropowy:

Rozpuszczalnik Wskaźnik polarności wg Snydera (J. of Chrom. 92.233,1974)

n-heksan. 0,0

cykloheksan 0,0

tetrachlorek węgla 1,7

toluen 2,3

dichlorometan 3,4

butan-1-ol 3,9

octan etylu 4,3

chloroform 4,4

aceton 5,4

etanol 5,2

metanol 6,6

woda 9,0.

X

---