Ćwiczenie IV.

I. Trawienie DNA faga λ za pomocą enzymu restrykcyjnego EcoRI
II. Analiza elektroforetyczna produktów reakcji trawienia.

III. Oznaczanie DNA wyizolowanego z komórek.

Do kolokwium obowiązuje materiał z wykładów - enzymy restrykcyjne (i inne nukleazy), oraz instrukcja BHP

Część I. Trawienie enzymem restrykcyjnym EcoRI.

Materiał i odczynniki:

DNA faga λ o stężeniu 0.5 μg/μl

Bufor do trawienia 10x stężony

Enzym restrykcyjny EcoRI 10 U*/μl

H₂O dejonizowana

Mieszanina reakcyjna (10 µl):

0,5 μg DNA faga λ

5 U enzymu EcoRI

w buforze do trawienia o składzie (1x): 50 mM NaCl

100 mM Tris:HCl pH 7.9

5 mM MgCl2

0.025% Triton X-100

Wykonanie:

1. Obliczyć ilości DNA, buforu, enzymu i H₂O potrzebne do złożenia reakcji (objętość końcowa 10 μl) i zmieszać we właściwej kolejności (ramka poniżej). Po enzym należy podejść do prowadzącego. Wstawić mieszaninę do inkubacji w 37⁰C (1 godzina)

*1 jednostka enzymatyczna (1 U) jest to ilość enzymu przekształcającego 1 jednostkę masy (g, mg, μg) substratu w jednostce czasu (godzina, minuta) w temperaturze i warunkach optymalnych dla działania enzymu.

W przypadku enzymów restrykcyjnych jedna jednostka enzymatyczna jest to ilość enzymu przecinającego 1 μg DNA w czasie 1 godziny w temperaturze 37⁰C (dla nielicznych enzymów restrykcyjnych optymalna temperatura inkubacji jest inna) .

Aby mieć pewność, że DNA zostanie dokładnie strawiony, do mieszaniny reakcyjnej
dodaje się 2-10 jednostek enzymu na 1 μg DNA.

Część II. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym.

Odczynniki:

Agaroza

Bufor przewodzący TAE 50x ((0.2 M Tris:octan; 0.05 M EDTA)

Roztwór bromku etydyny 10 mg/ml

A. Przygotowanie 0.8% żelu agarozowego do elektroforezy (30 lub 100 ml) - jeden na dwie grupy (zaraz po kolokwium):

1. Przygotować saneczki z blokadą i grzebieniem.

2. Naważkę agarozy (0.24g/ 0.8g) rozpuścić w 29.4/98 ml H₂O, zagotować w kuchence mikrofalowej, przestudzić do temp. ok. 50⁰C.

3. Dodać 0.6/2 ml (1/50 objętości) buforu TAE 50x i 2/6,7 μl bromku etydyny (uwaga, rakotwórczy!) - u prowadzącego ćwiczenia.

4. Agarozę wylać do przygotowanych saneczek (z blokadą i grzebieniem). Zostawić do zżelowania.

5. Przygotować 400/600 ml buforu 1x TAE.

6. Wyjąć grzebień i blokady, wstawić saneczki z żelem do aparatu i zalać buforem przewodzącym.

B. Przygotowanie prób (w czasie tężenia agarozy) i elektroforeza:

Odczynniki:

Bufor obciążający: 0.25% błękit bromofenolowy; 0.25% cjanol ksylenu; 30% glicerol

Wzorzec masy: DNA faga lambda/HindIII z buforem obciążającym (0.5 μg/5µl)

1. Próby DNA faga lambda po trawieniu EcoRI wyjąć z inkubacji i dodać 2 μl buforu obciążającego do elektroforezy.

2. Przygotować próbę nietrawionego faga lambda (jedna na całą grupę - sekcja 1): 1 μl DNA + 5 μl H₂O + 1 μl buforu obciążającego.

3. Nanoszenie prób:

1. Marker - 5 μl

2. nietrawiony DNA faga lambda

3. DNA faga lambda po trawieniu enzymem restrykcyjnym

4. Elektroforeza DNA 80-100 V, około 1 godziny

5. Oglądanie DNA w świetle UV

Część III. Pomiar stężenia DNA wyizolowanego z komórek ludzkich z poprzedniego ćwiczenia (w czasie trwania elektroforezy).

Zmierzyć objętość roztworu DNA, pobrać 2 μl do nowej probówki, zawierającej 98 μl H₂O (rozcieńczenie: 50x). Przygotować próbę kontrolną - 100 μl H₂O dejonizowanej.

Pomiar absorpcji światła odbywa się dla długości fali:
230 nm (zanieczyszczenia białkowe - wiązania peptydowe, węglowodory)

260 nm (szczyt absorpcji dla DNA)

280 nm (szczyt absorpcji dla białek - aminokwasy aromatyczne, fenole)

320 nm (wytrącenia w roztworze, brud)

Obliczenie stężenia DNA:

C [μg/μl] = (A₂₆₀ -A₃₂₀) x rozcieńczenie x 0.05

Sprawozdanie:

Izolacja DNA z komórek hodowanych - RKO lub HCT116 (rak jelita grubego) sposób postępowania.

Należy wpisać ile razy próba była odbiałczana, jaka była objętość roztworu DNA po odbiałczeniu, oraz w jakiej objętości TE DNA zostało rozpuszczone po wytrąceniu (dla większej dokładności lepiej podać objętość DNA zmierzoną przed oznaczeniem stężenia).

W wynikach należy wpisać stężenie DNA (w μg/μl), oraz całkowitą ilość DNA wyizolowaną z komórek (stężenie x objętość roztworu DNA). Policzyć orientacyjną wydajność biorąc pod uwagę straty poniesione w trakcie odbiałczania.

We wnioskach opisać czystość DNA (dla czystego DNA stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ powinien wynosić 1.5-1.9, A₂₆₀/A₂₃₀ - powyżej 2), wydajność (porównać z kolegami z innych sekcji), procentową i w wartościach bezwzględnych. Opisać powody niewielkiej wydajności przy izolacji DNA.

We wszystkich reakcjach enzymatycznych kolejność dodawania odczynników do probówki jest następująca:

1. H₂O

2. bufor

3. substrat(y)

4. enzym(y)

Taka kolejność dodawania ułatwia właściwe buforowanie próby badanej (materiał biologiczny to często są substancje labilne), zapewnia właściwe proporcje substratów i ułatwia zachowanie aktywności enzymatycznej na właściwym poziomie.

---