Fotometryczna analiza ilościowa białka za pomocą metody Lowry'ego i współpracowników (A) oraz metody spektrofotometrycznej (B)

Część A:

Wykonanie:

Do probówek odmierzamy w 2 powtórzeniach po 0,5 ml z 5 różnych roztworów wzorcowych białka (albumina wołowa o stężeniach 20, 40, 80, 140, 200 μg/ml) oraz do kolejnych dwóch po 0,5 ml otrzymanego roztworu białka (w kolbce miarowej na 10 ml dopełniamy go najpierw wodą destylowaną do kreski i mieszamy). Robimy również próbę kontrolną odmierzając do czystej probówki 0,5 ml wody destylowanej. Do wszystkich probówek dodajemy po 2,5 ml odczynnika miedziowego, mieszamy i po 10 minutach dodajemy po 0,25 ml odczynnika Folina, całość natychmiast mieszamy używając np. mikrowytrząsarki do probówek. Po 30 minutach mierzymy intensywność zabarwienia w fotometrze przy 750 nm. Na podstawie uzyskanych wartości absorbancji wykreślamy krzywą zależności absorbancji od stężenia białka w próbie.

Wyniki i obliczenia:

Dzięki fotometrowi otrzymaliśmy następujące wartości absorbancji, dla danych stężeń badanego białka:

Stężenie białka [μg/ml]	A1	A2	A (średnia)
0	0,000	0,000	0,000
20	0,023	0,048	0,0355
40	0,074	0,09	0,082
80	0,16	0,128	0,144
140	0,305	0,327	0,316
200	0,383	0,372	0,3775

Dla badanej próbki, gdzie szukamy stężenia białka, wartość absorbancji wynosiła 0,342. Przy pomocy wykresu krzywej wzorcowej możemy otrzymać wartość szukanego stężenia białka. W tym przypadku linia regresji wynosiła A = 0,00199 * stężenie białka, wobec czego samo stężenie badanego białka, dla otrzymanej absorbancji 0,342 wyniosło 171, 85 μg/ml.

171,85 μg białka znajdowało się w 0,5 ml próbki

więc dla 10 ml w kolbce wyniosło 171,85 μg * 20 = 3437 μg

Do kolbki przed dopełnieniem jej wodą do objętości 10 ml wlano w tym przypadku 3 ml analizowanego roztworu albuminy technicznej, więc

W 3 ml albuminy technicznej było 3437 μg białka, zatem w 1000 ml było 3437 μg * 1000/3 = 1145666 μg białka, czyli 1145,6 mg albuminy.

W 1000 ml rozpuszczono 500 mg albuminy technicznej zatem:

500 mg - 100 %

1145,6 mg - x %

x = 229,12 %

Część B:

Wykonanie:

Do odpowiedniej kuwety odmierzamy najpierw wodę destylowaną, wyzerowujemy spektrofotometr przy długości fali 280 nm, następnie mierzymy absorbancji dla otrzymanego roztworu białka znajdującego się w kolbce. Pomiar powtarzamy po wyzerowaniu spektrofotometru przy długości fali 260 nm. Zmierzone absorbancji nie powinny przekroczyć wartości 1,000.

Wyniki i obliczenia:

Absorbancja 280 nm	Absorbancja 260 nm
0,076	0,049

Białko (μg/ml) = 1,55 * 0,076 - 0,76 * 0,049 = 0,1178 - 0,03724 = 0,08056

W 1 ml próby znajduje się 80,56 μg białka

W 10 ml w kolbce znajduje się 805,6 μg

Do kolbki przed dopełnieniem jej wodą do objętości 10 ml wlano 3 ml analizowanego roztworu albuminy technicznej, więc

w 3 ml roztworu albuminy było 805,6 μg białka,

w 1000 ml będzie 805,6 μg białka * 1000/3 = 268533 μg, czyli 268,533 mg albuminy

W 1000 ml rozpuszczono 500 mg albuminy technicznej, zatem:

500 mg - 100%

268,533 mg - x%

x - 53,7 %

Wnioski z obu części:

Wyniki otrzymane z obydwu części wskazują na dość nieprecyzyjne oznaczanie ilościowe białka w danym roztworze. Może to wynikać z dużych błędów pomiarów, gdyż w obydwu wynikach wartości białka w roztworze albuminy technicznej powinny być zbliżone do 100%.

---