Oznaczanie aktywności amoniakoliazy L-fenyloalaniny w roślinnym ekstrakcie bezkomórkowym.

(Praca w grupach 3-osobowych)

Materiały:

- kiełki fasoli

- aceton

- 0.1 M bufor boranowy (pH 8.8),

- 0.03 M r-r L-fenyloalaniny w buforze boranowym

Otrzymanie ekstraktu enzymatycznego:

1. 5 g kiełków fasoli umieścić w moździerzu, dodać 20 ml acetonu i rozetrzeć.

2. Uzyskaną mieszaninę odwirować (4000 rpm, 5 min), używając szklanych gilz.

3. Uzyskany osad przenieść na bibułowy sączek umieszczony na szklanej szalce i osuszyć w cieplarce w temperaturze 30°C.

4. 200 mg osadu przenieść do zamykanej probówki szklanej i ekstrahować 10 ml buforu boranowego przez 15 minut.

5. Zawiesinę przenieść do 2 probówek wirówkowych i odwirować (6000 rpm, 5 min).

6. W uzyskanym ekstrakcie bezkomórkowym oznaczyć aktywność badanego enzymu.

Oznaczanie aktywności amoniakoliazy L-fenyloalaniny w ekstrakcie bezkomórkowym:

1. Do probówki A (próba kontrolna) wprowadzić: 1ml 0.03 M r-ru L-fenyloalaniny, 1 ml buforu boranowego oraz 1 ml wody i dokładnie wymieszać.

2. Do próbówki B (próba właściwa) wprowadzić: 1ml 0.03 M r-ru L-fenyloalaniny, 1 ml buforu boranowego, 0.8 ml wody, oraz 0.2 ml ekstraktu i dokładnie wymieszać.

3. Do probówki C wprowadzić: 1 ml buforu boranowego, 1.8 ml wody, oraz 0.2 ml ekstraktu i dokładnie wymieszać.

4. Wszystkie próbówki inkubować w temperaturze 30°C przez 30 minut.

5. Zmierzyć absorbancję prób B i C wobec kontrolnej (A) przy długości fali λ=290nm.

6. Aktywność enzymu, wyrażoną jako stężenie produktu, obliczyć ze wzoru:

C=A_B-A_C/a*b (C - stężenie produktu [mM], A_B, A_C - absorbancja odpowiedniej próby, a - grubość kuwety, b=9.33 1/Mm*cm - milimolowy współczynnik absorpcji)

---