Ćwiczenie 3

Izolacja DNA z hodowanych komórek eukariotycznych

Materiał do kolokwium: metoda izolacji DNA, budowa DNA (wzory strukturalne), oddziaływania białko-DNA (typy wiązań), instrukcja do ćwiczeń.

Proszę przynieść okulary ochronne

Wstęp teoretyczny:

Aby wyizolować DNA z komórek należy usunąć z nich wszystkie pozostałe związki. Przede wszystkim konieczne jest zniszczenie integralności błony komórkowej, co można osiągnąć przy użyciu wysokich stężeń soli i/lub detergentów. Zawartość komórek trawiona jest następnie enzymami proteolitycznymi w środowisku hamującym aktywność enzymów nukleolitycznych, a więc: EDTA (związki chelatujące wiążą jony metali dwuwartościowych - przede wszystkim Mg⁺², które są kofaktorami nukleaz), środowisko denaturujące białka (detergenty, np. SDS), same enzymy proteolityczne degradujące większość białek komórkowych, także enzymatycznych. Same proteazy (np. proteinaza K), ze względu na swoją budowę są dość odporne na działanie niskich stężeń detergentów. Proteinaza K wykorzystywana w tych ćwiczeniach jest protezą serynową wydzielaną przez kultury niektórych śluzowców. Ma niewielką specyficzność trawienia, co oznacza, że może trawić liczne białka, bez względu na ich sekwencję. Proteinaza K łatwo inaktywuje DNazy i nie traci aktywności w mieszaninach zawierających do 0.5% SDS.

Enzymy proteolityczne (także proteinaza K) nie trawią białek do pojedynczych aminokwasów. Niestrawione białka i peptydy otrzymane w wyniku trawienia muszą być usunięte przy pomocy substancji powodujących denaturację i wytrącanie białek (tzw. odbiałczanie). Takimi substancjami mogą być organiczne rozpuszczalniki: fenol i chloroform. Związki te, cięższe od wody, pozostawiają w roztworze kwasy nukleinowe i drobnocząsteczkowe zanieczyszczenia, natomiast powoduja wytrącanie białek, które zbierają się na granicy faz, pomiędzy gaza wodną i organiczną. Kilkakrotne traktowanie tymi związkami zanieczyszczonych białkami roztworów DNA może usunąć większość białkowych zanieczyszczeń.

Roztwory DNA po odbiałczaniu zawierają jeszcze szereg zanieczyszczeń drobnocząsteczkowych. Ich usunięcie, oraz zagęszczenie DNA jest możliwe poprzez wytrącenie DNA z roztworu przy pomocy alkoholu etylowego. Alkohol etylowy usuwa z DNA płaszcz wodny, co w roztworze o niskim pH znakomicie ułatwia wypadanie kwasu nukleinowego z roztworu. Wytrącony DNA można potem odwirować i rozpuścić w niewielkiej ilości wody lub buforu TE. W tym ćwiczeniu równocześnie z DNA powinien się też oczyszczać RNA, co wynika z ich podobnych właściwości. Usunięcie RNA wymaga dodatkowego trawienia oczyszczonego roztworu RNazą, na co w tym ćwiczeniu brakuje czasu. Dodatkowo obecność RNA stanowi dobrą kontrolę jakości wyizolowanego preparatu.

Materiały i odczynniki:

Zamrożone, zwirowane komórki ludzkie z ustalonych linii hodowlanych

Bufor do ekstrakcji: 3M NaCl, 0.4 M Tris:HCl pH 7.8, 20 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)

20% SDS (siarczan dodecylanu sodu)

Roztwór proteinazy K o stężeniu 20 mg/ml

Fenol:chloroform 1:1, wysycony buforem Tris:HCl pH 6.7 (Uwaga! Substancja żrąca!)

Chloroform:alkohol izoamylowy (29:1)

Bufor TE: 10 mM Tris:HCl pH 7.8, 1 mM EDTA

3M octan sodu pH 5.2

Alkohol etylowy 96%

Alkohol etylowy 70%

Wszelkie probówki z preparatami mają być podpisane przed odpipetowaniem preparatów

Wykonanie:

1. Osad komórek należy rozmrozić w lodzie (5 min.), dodać 400 l buforu do ekstrakcji, zawiesić, dodać 8 l 20% SDS, delikatnie wymieszać.

2. Dodać 2 l proteinazy K (stężenie końcowe: 100 g/ml), delikatnie wymieszać.

3. Wstawić do termobloku (55⁰C) na 1 godzinę (trawienie).

4. Odbiałczanie:

1. Dodać równą objętość (400 l) mieszaniny fenol:chloroform (pod wyciągiem!), energicznie wytrząsać przez 30 sekund, zwirować 14 000 obr./min. przez 2 min.

2. Delikatnie zebrać górną warstwę (faza wodna) do nowej probówki.

3. Powtarzać do zaniku fazy białkowej (2-3x)

4. Dodać równą objętość mieszaniny chloroform: alkohol izoamylowy (pod wyciągiem!), energicznie wytrząsać przez 30 sekund, zwirować 14 000 obr./min. przez 2 min.

5. Delikatnie zebrać górną warstwę (faza wodna) do nowej probówki.

5. Zmierzyć objętość fazy wodnej i dodać buforu TE tak, aby objętość końcowa wynosiła 400 l.

6. Dodać 1/10 objętości 3M octanu sodu i dwie objętości zimnego alkoholu etylowego 96%.

7. Wstawić do suchego lodu (-80⁰C) na 10 min.

8. Preparat wirować 15 min. 14 000 obr/min (rpm) z chłodzeniem (wirówka w szafie chłodniczej).

9. Delikatnie ściągnąć supernatant (SN, nadsącz, płyn nad osadem) i odrzucić, osad przepłukać delikatnie (nie zawieszać w roztworze) zimnym alkoholem 70%.

10. Zwirować 14 000 rpm, 5 min., dokładnie zebrać nadsącz i odrzucić, osad wysuszyć na powietrzu 10-15 min., zawiesić w buforze TE i zostawić do rozpuszczenia (ok. 24 godz.) w szafie chłodniczej.

---