Paulina Rusinek, Aleksandra Smędzik, grupa poniedziałek 12.15 10.12.12

5.1 Oznaczanie glukozy metodą Somogyi-Nelsona

Zasada oznaczenia:

W reakcji glukozy z jonami Cu2+ powstaje tlenek miedzi (II). Reaguje z odczynnikiem zawierającym kwas arsenomolibdenowy, który redukuje się do błekitu molidbenowego. Intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do ilości tlenku miedzi (I), a więc do zawartości glukozy w oznaczanym roztworze.

Wykonanie: według skryptu.

Opracowanie wyników

Absorbancja dla poszczególnych probówek:

Nr probówki	I próba	II próba	Średnia	Stężenie glukozy [μg/μl]
1	0,080	0,050	0,065		0,02
2	0,150	0,140	0,145		0,04
3	0,350	0,360	0,355		0,08
4	0,400	0,530	0,465		0,12
5	0,650	0,650	0,650		0,16

Stężenie glukozy w poszczególnych probówkach krzywej kalibracyjnej obliczono w następujący sposób (przykład dla probówki I):

200μg - 1ml (ponieważ stężenie wyjściowego r-u wynosiło 200 μg/ml, a dodano 50 μl = 0,05 ml r-u glukozy)

x - 0,05 ml

x = 10μg

Końcowa objętość roztworu wynosiła w każdym wypadku 0,5 ml.

10 μg/500 μl = 0,02 μg/μl

Stężenia dla pozostałych probówek obliczono w analogiczny sposób.

Równanie prostej opisującej zależność absorbancji od stężenia glukozy ma postać:

y = 4,0351x

Absorbancja próbki I: 0,12

Absorbancja próbki II: 0,10

Średnia: 0,11

0,11 = 4,0351 x

x = 0,027 μg/μl = 0,027 mg/ml

Końcowa objętość roztworu, w którym mierzono absorbancję, wynosiła 5 ml.

1ml - 0,027 mg

5ml - x

x= 0,135 mg

Cała zawarta w 5 ml roztworu glukoza pochodziła z 0,5 ml próbki odbiałczanej. Próbka odbiałczana miała końcową objętość 1,2 ml.

0,5ml - 0,135mg

1,2 ml - x

x= 0,324mg

Glukoza w próbce odbiałczanej pochodziła z 50 μl surowicy.

50 μl - 0,324mg

1000 μl - x

x = 6,480 mg

Zawartość glukozy w 1 ml surowicy to 6,480 mg, a więc stężenie glukozy w surowicy wynosiło 6,480 mg/ml = 6,480 g/l.

Masa molowa glukozy wynosi 180 g/mol.

180 g - 1 mol

6,480g - x mol

x = 0,036 mol

Wniosek :

Stężenie glukozy w surowicy wynosiło 0,036 M = 36 mM. Oznacza to hiperglikemię, ponieważ normalne stężenie to 3,6 - 6,1 mM.

5.2 Oznaczanie aktywności glukozo-6-fosfatazy (EC 3.1.3.9)

Zasada oznaczenia:

Glukozo-6-fosfataza odszczepia fony fosforanowe z glukozo-6-fosforanu, które reagują z molibdenianem (VI) amonu, dając sól molibdenianowofosforanową. Sól ta po działaniem eikonogenu ulega redukcji do błękitu molibdenowego. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości jonów fosforanowych przed reakcją.

Wykonanie: według skryptu.

Opracowanie wyników

Absorbancja próby badanej (pomiar względem próby kontrolnej):

1μmol - 0,43 (wg skryptu)

x μmol - 0,035

x = 0,081 μmol (w 1,5 ml)

wiec:

0,081 μmol - 1ml

x μmol - 2ml

x = 0,109 μmol

0,1ml enzymu - 0,109 μmol

1 ml enzymu - x

x = 1,085 μmol

(uwolnione przez 1 ml nierozcieńczonego enzymu w ciągu 30 minut inkubacji)

Przez pierwsza godzinę zależność między ilością uwolnionego substratu a czasem inkubacji jest prostoliniowa, więc ilość produktu uwolnionego w ciągu 1 minuty można obliczyć z proporcji.

30 min - 1,085μmol

1 min - x

x = 0,036μmol

Wniosek :

Aktywność glukozo-6-fosfatazy wynosi: 0,036μmol/min

Znaczy to, że w ciągu 1 min enzym przetwarza 0,036μmol cukru.

5.3 Wykazanie specyficzności substratowej enzymów inwertazy (EC 3.2.1.26) oraz amylazy (EC 3.2.1.1)

Zasada oznaczenia:

Amylaza hydrolizuje wiązania w obrębie cząsteczki skrobi, natomiast inwertaza w obrębie cząsteczki sacharozy. Produkty hydrolizy obu cukrów mają właściwości redukujące, natomiast same cukry nie. Obecność związków redukujących w mieszaninie reakcyjnej świadczy o zajściu reakcji.

Wykonanie: według skryptu.

Opracowanie wyników

Zawartość probówki	Obserwacja
skrobia, amylaza	czerwone zabarwienie
skrobia, inwertaza	brak zmian zabarwienia
sacharoza, amylaza	brak zmian zabarwienia
sacharoza, inwertaza	czerwone zabarwienie

Wniosek:

Czerwone zabarwienie w probówkach zawierających skrobię i amylazę oraz sacharozę i inwertazę świadczy o zajściu w nich reakcji enzymatycznej. Oznacza to, że działanie każdego z enzymów ograniczone jest do określonego typu wiązań. Dla amylazy są to znajdujące się w skrobi wiązania α-(1→4)-glikozydowe, a dla inwertazy znajdujące się w sacharozie wiązania β-(1→2)-glikozydowe.