11.04.2012 - Wykład 9

TEMAT: Apoptoza

Szczegółowo opracowana na ćwiczeniach.

Fizjologiczna śmierć komórki (śmierć zaprogramowana) synonim apoptoza.

Jest konsekwencją samobójczego programu genetycznego, uruchomianego w odpowiedzi na złożone oddziaływanie z innymi komórkami.

Najczesciej nastepuje naruszenie integralność 1 z 4 systemów wewnatrzkomórkowych:

- oddychania tlenowego

- funkcjonowania błon komórkowych

- enzymów białek strukturalnych

- naprawy aparatu genetycznego

apoptoza Caenorhabiditis elegans

dorosły osobnik jest hermafrodytą i składa się z 959 komórek somatycznych. Liczba komórek powstających 1090. w wyniku apoptozy ginie 131

-113 umiera podczas embiogenezy

- 18 podczas dorosłego życia

Genetyczna kontrola apoptozy:

- „ced” geny śmierci są dobrze zachowane w procesie ewolucji

- ekspresja genów ced-3 i ced-4 odpowiada za molekularne procesy apoptozy

- ced-9 (u ludzi bcl-2) ekspresja w komórkach stymulowanych do proliferacji ( m. in. limfocyty prawidłowe, kom. nowotworowe)

Zdrowa komórka -> Komórka obkurcza się i oddziela od komórek sąsiednich -> Powstawanie pęcherzyków (uwypuklenie) kondensacja chromatyny i cytoplazmy -> Marginacja skondensowanej chromatyny -> Fragmentacja jądra i komórki ->Ciałka apoptotyczne -> Fagocytoza

Różnice morfologiczne pomiędzy apoptozą a martwicą:

Apoptoza:

1. Dotyczy zwsykle pojedynczych komórek

2. Zmniejszenie objętości komórki i pofałdowanie błony komórkowej

3. Kondensacja chromatyny, fragmentacja jądra

4. Zamknięcie organelli w ciałkach apoptotycznych

5. Ciągłość błony kom. zachowana aż do momentu sfagocytowania ciałek apoptotycznych

6. Brak zapalenia, hamowanie rekacji zapalnej

7. Fagocytoza przez sąsiednie komórki i makrofagi

Martwica:

1. Najczęściej dotyczy grup komórek

2. Zwiększenie objętości i pęcznienie komórki

3. Brak kondensacji chromatyny, liza jądra

4. Pęcznienie i rozpad organelli

5. Perforacja błona, zawartość komórek wydostaje się do przestrzeni pozakomórkowej

6. Odczyn zapalny ze strony otoczenia

7. Fagocytoza przez fagocyty.

Zmiany biochemiczne:

Materiał genetyczny:

- Apoptoza: aktywacja specyficznych endonukleaz, fragmentacja, utworzenie odcinków o długości 200-300 kb, 20-50 kb, 200-300 bp

- Martwica: Aktywacja niespecyficznych nukleaz, fragmentacja na odcinki o przypadkowej długości,

Rozdział elektroforetyczny DNA:

- Apoptoza: obraz drabinki DNA

- Martwica: obraz smugi (smear)

Aktywacja enzymów:

- Apoptoza: kinaz białkowych (np. kinazy MAP) i fosfataz, nukleaz, kaspaz, kalpain

- Martwica: niespecyficzna degradacja

Czynniki wywołujące apoptozę:

- hormony i cytokiny

- deficyt czynników wzrostowych i troficznych

- czynniki cytotoksyczne

- czynniki fizyczne

Szlaki sygnałowe apoptozy

W zależności od rodzaju komórki i czynnika indukującego proces apoptozy może przebiegać różnymi ścieżkami.

Do najlepiej poznanych należą:

- szlak związany z błoną komórkową tzw. zewnętrzny,

- szlak wewnętrzny zwany mitochondrialnym,

- szlak angażujący perforyny i granzym B, czyli pseudoreceptorowy,

Apoptoza może również odbywać się z udziałem szlaku sfingomielinowo-ceramidowego oraz indukowanego stresem.

Szlak zewnętrzny:

- pobudzenie receptorów śmierci należących do nadrodziny receptorów TNF np. Fas/CD95/Apo1/TRAIL-R1 i R2/Apo2

- receptory śmierci posiadają wewnątrzkomórkową domenę śmierci DD,

- po związaniu się odpowiedniego ligandu z receptorem błonowym (TNF-alfa, FasL, TRAIL/Apo2l) dochodzi do oligomeryzacji receptora, a następnie powstaje kompleks DISC (

- kompleks ten powstaje poprzez połączenie domen śmierci z białkiem adaptorowym FADD oraz z prokaspazą 8,

- następuje aktywacja prokaspazy 8, która jest bezpośrednim aktywatorem kaspazy 3 (kaspazy wykonawczej),

Szlak wewnętrzny:

inicjowany jest poprzez:

- zmiany potencjału mitochondrialnego

- mutacje DNA

- inne zaburzenia metabolizmu komórkowego

Szlak ten może łączyć się ze ścieżką receptorową zewnętrzną poprzez białko Bid, które ulega proteolizie - powstaje tBid (truncated Bid) - postać ta wpływa na uwalnianie cytochromu c - aktywacja szlaku mitochondrialnego.

- istotnym etapem jest uwolnienie cytochromu c z przestrzeni międzybłonowej poprzez specjalne kanały,

- kanały te tworzenie są poprzez białka z rodziny Bcl-2 (bax, bak) z białkiem VDAC (Voltage Dependent Anion Channel

- przez kanały z mitochondrium do cytoplazmy dostaje się cytochrom c

- wpływ cytochromu c jest sygnałem do tworzenia kompleksu zwanego apoptosomem,

- apoptosom składa się z cytochromu c, prokaspaza 9, białka Apaf-1(ATP),

- kompleks ten potrzebny jest do autoproteolizy kaspazy 9, która następnie aktywuje kaspazę 3,

- podczas apoptozy z mitochondrium uwalniane są także białka Smac/Diablo i Oni/HTR A2 są one antagonistami inhibitorów apoptozy (IAP)

Szlak pseudoreceptorowy - indukowany przez cytotoksyczne limfocyty T oraz komórki NK,

- limfocyt w kontakcie z komórką docelową uwalnia perforyny,

- cząsteczki perforyny tworzą w błonie komórki docelowej kanały

- przez kanały wnikają granzymy B do komórki docelowej aktywujące szlak kaspaz,

- wraz z granzymami uwalniają się jony Ca2+ wpływające stymulująco na proces apoptozy

Właściwości kaspaz:

- proteazy cysteinowe, substraty ich zawierają kwas asparaginowy w pozycji P1 (proteoliza w miejscu reszty Asp)

- syntetyzowane są jako nieaktywne zymogeny

- dotychczas zidentyfikowano 14 kaspaz: kaspazy inicjatorowe -8, -9 również -2, -10; kaspazy wykonawcze -3, -6, -7

- kaspazy inicjatorowe posiadają „domeny śmierci” CARD i DED

- kaspazy wykonawcze aktywują enzymy prowadzące do destrukcji komórek

Białka trawione przez kaspazy:

- większość tych białek uczestniczy w procesach molekularnych związanych z cyklem komórkowym i apoptozą.

- do proteolizy białek dochodzi tylko przy udziale kaspaz -3, -6, -7,

Trawione są miedzy innymi białka:

- Białko PARP - bierze udział w rozpoznaniu i naprawie DNA

- białko ICAD

- białko Rb - kontroluje przechodzenie komórki przez kolejne fazy cyklu komórkowego

- białko MDM2 - wiąże się z białkiem p53 i je stabilizuje

- niektóre białka szkieletu komórki np. laminy, aktyna, fodryna,

- inne cząsteczki kaspaz

Śmierć komórki niezależna od kaspaz:

- proteaza aktywowana wapniem kalpaina, pełni autonomiczną rolę w apoptozie,

- ostatnie doniesienia wskazują na jej role w procesie aktywacji i unieczynnienia kaspazy-3, -7, -9 i ostatnio -12,

Proteazy serynowe: jedna z nich AP24 zaangażowana jest we fragmentację DNA,

- Katepsyna D, proteaza lizosomalna, zaangażowana w zewnątrzpochodną drogę aktywacji apoptozy,

- Także inne katepsyny mogą uczestniczyć w regulacji apoptozy,

Rodzina białek Bcl-2: białka proapoptotyczne ( Bax, Bad, Bak, Bik. Bid, Bcl-xs) zmuszają komórkę do apoptozy; antyapoptotyczna (Bcl-2, Bcl-x1, MCL-1) zwiększają prawdopodobieństwo przeżycia komórki

- pełnią funkcję regulatorów apoptozy przez oddziaływanie na wiele istotnych procesów komórkowych, jak:

- kontrola komórkowego poziomu jonów (Ca2+, H+, K+, Cl-) - tw3orza konały wbudowywane między innymi w błony mitochondrialne

- nadzór nad stanem redoks

- regulacja wypływu z mitochondriów cytochromu c i AIF

- aktywacja enzymów kaspaz i DN-az

Rodzina białek Bcl-2

-Tworza homo i heterodimery:

- stosunek homodimerów antyapoptotycznych do proapoptotycznych decyduje o śmierci bądź przeżyciu komórki

- połączenie się białek w heterodimery o przeciwnstawnym charakterze powoduje inhibicję biologicznej ich aktywności

Fizjologiczne znaczenie apoptozy:

- apoptoza jest procesem i przeciwstawnym do mitozy i wspólnie z nią decyduje o liczbie komórek w każdej populacji

- ma ogromne znaczenie w embriogenezie, wzroście i rozwoju

Przykłady apoptozy w rozwoju kręgowców:

- śmierć komórek ogona kijanki w procesie metamorfozy,

- śmierć blisko połowy neuronów powstających w trakcie embriogenezy w rozwoju układu nerwowego,

- śmierć komorek soczewki oka w czasie jej kształtowania

- zanik błony pławnej między palcami u zarodka ludzkiego

- w życiu postnatalnym: apoptoza keratynocytów skóry, krypt jelitowych,

Apoptoza w stanach patologicznych

Ograniczenie apoptozy prowadzi do powstania:

- nowotworów,

- autoagresji komórek układu odpornościowgo,

Wzrost apoptozy jest charakterystyczny dla chorób zwyrodnieniowych: choroby Alzhaimera, Parkinsona, AIDS, zwału sercu czy udaru mózgu.

4

---