Charakterystyka enzymów restrykcyjnych

(endonukleazy restrykcyjne czyli restryktazy)

Enzymy restrykcyjne - enzymy izolowane z bakterii lub sinic, rozpoznające specyficzne

sekwencje i przecinające obie nici w cząsteczce DNA. Związane są ze zjawiskiem restrykcji i

modyfikacji, którego model zaproponowali Arber i Dusoix w 1962 roku. Model ten zakłada istnienie w komórce dwóch enzymów w których jeden odpowiada za rozpoznanie specyficznej sekwencji i przecięcie DNA a drugi za jego modyfikację, która zapobiega atakowi nukleolitycznemu.

Nazewnictwo - enzymy restrykcyjne określa się za pomocą symboli, np. EcoRI - oznacza enzym wyizolowany ze szczepu R Escherichia coli, Hind III - enzym wyizolowany ze szczepu Hemophilus influenzae serotyp d. Liczba rzymska wynika z chronologii izolowania enzymów z tych samych mikroorganizmów.

Rozróżniamy trzy klasy enzymów restrykcyjnych, różniące się mechanizmem cięcia, rodzajem

substratu, produktu i kofaktorami:

Klasa I - białka multimeryczne wymagające jako kofaktorów ATP, S-adenylometioniny i Mg2+

• działają zarówno jako restryktazy oraz kodyfikacyjne metylazy

• substrat to dwuniciowy DNA zawierający zdefiniowaną sekwencję kilkunastu nukleotydów

• enzym rozpoznaje sekwencje i w pewnej odległości od niej nacina obie nici DNA, nie uzyskuje się ściśle określonych fragmentów DNA

Klasa II - białka proste, występują w postaci dimerów i tetramerów, in vitro aktywowane Mg2+

• odpowiadające im metylazy występują jako oddzielne białka monomeryczne

• substratem jest dwuniciowy DNA zawierający kilku nukleotydową sekwencje specyficznie

rozpoznawaną przez dany enzym

• cięcie obu nici zachodzi w obrębie tej rozpoznanej sekwencji lub jej pobliżu (klasa IIS)

• większość enzymów rozpoznaje palindromowe sekwencje (posiadające oś symetrii) cztero-,

sześcio-, lub ośmionukleotydowe. W wyniku ich cięcia mogą powstać dwa rodzaje końców

tzw „lepkie” i „tępe” końce

• enzymy te znalazły największe zastosowanie w biologii molekularnej

Klasa III - aktywowane przez jony Mg2+ i ATP, czasem potrzebna jest S-adenylometionina. Enzymy rozpoznają sekwencje i w pewnej odległości od niej nacinają obie nici DNA, nie uzyskuje się ściśle określonych fragmentów DNA.

Aktywność restryktaz zależy od:

• Stężenia soli (NaCl) zawartej w buforze,

• Temperatury, w której zachodzi reakcja

• Czystości mieszaniny reakcyjnej (obecność zanieczyszczeń np. glicerolu, etanolu, chloroformu

może powodować tzw. „star activity”)

• Obecności kofaktorów

• Odpowiedniego pH

Wszystkie enzymy restrykcyjne po trawieniu dwuniciowego DNA pozostawiają grupę fosforanową na końcu 5', a grupę hydroksylową na końcu 3'.

Wydaje się, że przecięcie dwóch nici w obrębie rozpoznanej sekwencji nie zachodzi jednocześnie, lecz jest wynikiem dwóch niezależnych reakcji katalitycznych. Stosując odpowiednio niskie stężenie enzymu w stosunku do stężenia DNA można uzyskać cząsteczki z tylko jedną przeciętą nicią.

IZOSCHIZOMERY - enzymy pochodzące z różnych szczepów, ale rozpoznające te same

sekwencje DNA. Na przykład sekwencję CCGG rozpoznają enzymy HpaII, HapII, MspI, BsnF.

NEOSCHIZOMERY (heteroschizomery) - enzymy pochodzące z różnych szczepów, rozpoznające te same sekwencje DNA, ale tnące w różnych pozycjach.

IZOKAUDOMERY - enzymy rozpoznające różne sekwencje, które tnąc pozostawiają takie same końce. Końce te są kompatybilne i mogą być łatwo łączone.

Trawienie enzymami restrykcyjnymi

• Skala analityczna

• Od 0,05 do 1µg

• Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej ~ 20µl

• Skala preparatywna

• > 1µg - 10µg

• Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej do 50µl

Zastosowanie restryktaz:

1. Sporządzanie fizycznych map genomów,

2. Izolacja i identyfikacja genów, sekwencjonowanie DNA,

3. Porównywanie DNA z różnych organizmów,

4. Rekombinowanie i klonowanie określonych genów lub fragmentów genomu,

5. Diagnostyka chorób genetycznych,

6. Diagnostyka niektórych chorób nowotworowych,

7. Diagnostyka chorób infekcyjnych,

8. W transpalntologii do ustalania zgodności tkankowej,

9. W medycynie sądowej do ustalania pokrewieństwa.

Oznaczanie stężenia roztworu DNA

• Mierzy się absorbancję przy długości fali λ=260nm, λ=280nm i λ=320nm. Pasmo o maksymalnej absorpcji przy λ=280nm jest charakterystyczne dla białek. Zanieczyszczenia białkami obniżają stosunek A₂₆₀/A₂₈₀, więc stosunek ten świadczy o czystości preparatu. Jedna jednostka absorbancji (przy drodze optycznej 1 cm) odpowiada roztworowi zawierającemu 1jednostkę OD. Najdokładniej oznacza się tą metodą stężenie DNA przy rozcieńczeniach dających absorpcję przy λ=260nm do 0,1-1,0 j.OD.

• W dobrze oczyszczonym preparacie DNA lub RNA:

OD₂₆₀/OD₂₈₀ = 1,8-2,0

• < 1,8 - preparat zanieczyszczony białkami

• > 2,0 - preparat zanieczyszczony RNA

• stężenie DNA = (A_260nm- A_320nm) x b x rozcieńczenie

• 1 j.OD = 50µg/ml dwuniciowy DNA

• 1 j.OD = 40µg/ml jednoniciowy DNA i RNA

• 1 j.OD = 20µg/ml oligonukleotydy

3

---