METODY HODOWLI I IDENTYFIKACJI GRZYBÓW.

WYKRYWANIE I ILOŚCIOWE OZNACZANIE

W PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH PLEŚNI I DROŻDŻY

1. Pleśnie - grzyby nitkowate:

- wytwarzają grzybnię (mycelium) złożoną z rozgałęzionych komórek (strzępek - hyphae); u grzybów niższych strzępki są jednokomórkowe, zwykle wielojądrowe, natomiast u grzybów wyższych są podzielone poprzecznymi przegrodami (septami), a każda oddzielna komórka ma jedno jądro

- typy grzybni:

+ powietrzna - rozwija się na powierzchni podłoża, często w formie puchu lub pleśni

+ substratowa (pożywkowa) - grzybnia wnikająca w podłoże

- dla większości optymalna temperatura mieści się w zakresie 18-22^oC (mała odporność na podwyższoną temperaturę - giną >60-70^oC; przeżywają tylko zarodniki), pH 5-6

- rosnąc powierzchniowo na podłożach mogą korzystać z dużych ilości tlenu  szybsze przyswajanie substancji odżywczych z podłoża.

2. Pleśnie w żywności:

- pleśnie wykorzystywane w produkcji żywności - niektóre gatunki grzybów są stosowane do produkcji enzymów proteolitycznych, amylolitycznych, celulolitycznych i innych, a także do produkcji kwasów organicznych (np. cytrynowego, glukonowego) i serów pleśniowych:

+ kwas cytrynowy - Aspergillus niger

+ enzymy - Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Trichoderma i inne

+ żywność orientalna (sosy sojowe) - Aspergillus flavus-oryzae

+ sery pleśniowe - Penicillium roqueforti, P. camemberti.

- pleśnie niepożądane w żywności:

+ wzrost pleśni na produktach żywnościowych wywołuje niekorzystne zmiany (barwne naloty na powierzchni, mięknięcie, powstawanie śluzów, upłynnienie produktu)

+ rozwijają się na produktach suchych przechowywanych w wilgotnych warunkach oraz na produktach o bardzo dużym stężeniu cukru lub soli

+ w psuciu żywności biorą udział przedstawiciele różnych klas:

SLAJDY

3. Wykrywanie pleśni:

- preparat mikroskopowy - najczęściej przyżyciowy w kropli spłaszczonej

- hodowla:

+ podłoża płynne

+ agar z brzeczką (półprodukt stosowany przy produkcji piwa lub miodu pitnego)

+ agar ziemniaczany

+ podłoże Chapka (brak wzrostu Rhizopus)

+ cechy morfologiczne kolonii obserwuje się zwykle do 2-3 tygodni

- oznaczanie liczby pleśni:

+ metoda zalewowa - nanoszenie płynnego rozcieńczenia na płytkę, a następnie zalanie jej płynnym podłożem

+ oznaczenie liczby pleśni należy wykonać tylko z jednego rozcieńczenia, z którego wyrosło ≤100 kolonii.

4. Drożdże:

- ok. 1500 gatunków, z czego kilkanaście wykorzystuje się w procesach biotechnologicznych

- jednokomórkowce; rozmnażają się głównie przez pączkowanie

- optymalna temperatura wzrostu 20-30^oC przy pH 5-6

- tlenowce; w warunkach beztlenowych przeprowadzają fermentację alkoholową, która polega na beztlenowym rozkładzie cukrów prostych oraz niektórych dwu- i trójcukrów na alkohol etylowy i CO₂:

C₆H₁₂O₆ 2CH₃CH₂OH + 2CO₂ + 117 kJ (28 kcal)

- specyficzny składnik cytoplazmy - wolutyna (ziarnistości metachromatyczne, zapasowe źródło fosforanów; gromadzą się w komórkach podczas fermentacji, często brakuje ich w szybko rozmnażających się drożdżach

- w środowisku zasobnym w cukier mogą gromadzić glikogen (zużywany po wyczerpaniu węglowodanów

- wytwarzają także tłuszcze

- podział:

+ drożdże szlachetne - stosowane w przemyśle fermentacyjnym:

- piekarskie - Saccharomyces cerevisiae

- paszowe - S. cerevisiae, Candida utilis, C. tropicalis, C. plucherrima, Rhodotorula

- gorzelnicze - S. cerevisiae

- winiarskie - S. cerevisiae, S. ellipsoideus

- browarnicze - S. cerevisiae, S. carlsbergensis

+ drożdże dzikie - szkodniki w przemyśle fermentacyjnym i przetwórstwie żywności; zanieczyszczenia:

- przemysł winiarski:

+ najczęściej drożdże są oporne na wysokie stężenia SO₂ (używany często do konserwacji moszczów owocowych - sulfitacja moszczów)

+ przy dostępie tlenu rozwijają się Candida spp. i Pichia spp., które przeprowadzają przemianę etanol kwas octowy ester etylooctowy (zjełczały zapach wina)

+ mogą być przyczyną śluzowacenia i drożdżowego posmaku win

+ Pichia spp. i Kloeckera spp. biorą udział w przemianach związków siarki w winach, co w obecności etanolu sprzyja tworzeniu merkaptanów (nadają winom ostry, nieprzyjemny zapach)

- browarnictwo:

+ Torulopsis, Pichia, Hansenula, Candida, Saccharomyces, Kloeckera

+ jedna z przyczyn mętnienia i drożdżowego posmaku piwa

+ zakażenie ograniczone dużym stężeniem alkoholu etylowego

+ w zacierach fermentacyjnych spotyka się głównie C. mycoderma (ma zdolność rozkładu etanolu do CO₂ i H₂O zmniejszenie stężenia alkoholu w piwie)

- przemysł piekarniczy - C. mycoderma (walka z nimi jest trudna, gdyż przyrost ich masy w trakcie produkcji następuje równocześnie z rozwojem drożdży piekarniczych; powodują obniżenie siły pędnej drożdży piekarniczych)

- drożdże killerowe - produkują toksyny białkowe lub glikoproteinowe, które zabijają wrażliwe komórki drożdży tego samego lub innego gatunku

- drożdże osmofilne:

+ zdolność do wzrostu przy dużych stężeniach glukozy (60%)

+ rozwijają się na produktach o niskiej A_w (aktywność wody; minimum wody niezbędne dla rozwoju drobnoustrojów - czysta chemicznie woda ma wartość A_w = 1)

+ powodują psucie miodu, dżemu, syropów owocowych, soków

+ rozwijają się w marynatach i solankach (np. S. rouxi, S. mellis)

- inne drożdże niepożądane w żywności:

+ na osłonkach wędlin przechowywanych w lodówce - kredowe naloty

+ drożdże kożuchujące - psucie kiszonek

+ gatunki o właściwościach lipolitycznych - plamy na maśle i margarynie.

5. Wykrywanie drożdży:

- badanie mikroskopowe:

+ preparat bezpośredni - jeżeli badany materiał jest suchy (np. nalot na wędlinie) przed wykonaniem preparatu należy go rozetrzeć w 0,9% NaCl

+ preparat pośredni - np. połączony z barwieniem metodą Grama (drożdże są Gram(+))

+ preparat przyżyciowy niezabarwiony - najczęściej

+ barwienie przyżyciowe - oznaczenie żywotności ,wykrywanie substancji zapasowych

- hodowla:

+ podłoże płynne

+ agar z brzeczką

+ agar ziemniaczany

+ specjalne podłoża ubogie w składniki odżywcze (np. McClavy).

6. Ocena właściwości drożdży:

- ocena żywotności drożdży:

+ oznaczanie % zawartości martwych komórek:

X = b · 100 / (a+b)

+ normy w drożdżach piekarskich:

- drożdże prasowane ≤5% martwych komórek

- drożdże suszone ≤25% martwych komórek

- badanie na obecność glikogenu:

+ z wykorzystaniem płynu Lugola

+ czerwonobrunatne ziarnistości glikogenu widoczne na tle jasnożółtej cytoplazmy

- badanie na obecność tłuszczu - zabarwienie komórek roztworem Sudanu krople tłuszczu barwią się na granatowo.

7. Cechy morfologiczne i fizjologiczne ważne w identyfikacji drożdży:

- kształt komórek - 6 podstawowych kształtów, często charakterystycznych dla poszczególnych rodzajów (kulisty, elipsoidalny, cytrynkowaty, butelkowaty, cylindryczny, nitkowaty)

- wielkość komórek - pomiar minimum 20 komórek; zwykle 1-8 μm długości i 1-6 μm szerokości

- zdolność do tworzenia:

+ pseudogrzybni (pseudomycelium) - nitkowate struktury, często rozgałęziające się, złożone wyłącznie z komórek pączkujących lub pojedyncza, nitkowata komórka, mogąca rozgałęziać się, nieposiadająca przegród poprzecznych

+ grzybni

- zdolność do wytwarzania zarodników:

+ następuje w warunkach głodowych populacji i jest sposobem na przerwanie niekorzystnych warunków środowiska

+ najlepiej tworzą się przy małej ilości węglowodanów w podłożu oraz przy dobrym dostępie tlenu

- fermentacja cukrów - posiew na podłoże z dodatkiem 2% badanego cukru

- wykorzystanie azotanu jako źródła azotu - posiew na podłoże zawierające witaminy, ale bez innych źródeł azotu

- wykorzystanie etanolu jako źródła węgla - posiew na podłoże z dodatkiem etanolu

- rozkład tłuszczów.