16.03.2009, Ćwiczenia nr 4., - Proteosomy, Peroksysomy, Lizosomy.

Proteosomy.

• kompleks enzymów proteolitycznych umożliwiających pozalizosomową degradację białek w cytozolu

• struktury nieobłonione

• biorą udział w destrukcji białek

• złożone z 4 pierścieni, z których każdy zbudowany jest z 6 kompleksów białkowych

• białka te tworzą formę kanału wzmocnionego od zewnątrz kwasami nukleinowymi ( w postaci nieaktywnej 20 S) aby zaaktywować musza przyłączyć się czynniki CF1 i CF2 - zwiększa się wtedy stała sedymentacji do 26 S

• sygnałem do działania tych struktur są białka z ubikwityną(4,5):regulatorowe, uszkodzone itp.

• zachodzi tzw. ubikwitynizacja białek przeznaczonych do rozłożenia, jest w nich sygnał do destrukcji - 10 aminokwasów, tam przyłącza się białko rozpoznające a ono powoduje przyłączenie się ligazy ubikwitynowej i przyłącza się ubikwityna. Jedna jej jednostka powoduje przyłączenie następnych do 4,5 i takie białko jest rozpoznawalne przez proteasomy

Dwa rodzaje proteosomów.

• 20S - nieaktywna jednostka podstawowa

• 26S - aktywny kompleks enzymów degenerujących białka zkonigowanych z ubikwityną

Główne etapy proteolizy ubikwitynozależnej.

1. aktywacja ubikwityny z udziałem ATP

2. transestryfikacja - napiętnowanie ubikwityną białka przeznaczonego do degradacji

3. selekcja substratów białkowych skierowanych na drogę proteolizy

4. proteoliza zależna od ATP

5. uwolnienie ubikwityny

Lizosomy.

• Końcowy szlak endocytarny stanowiący populację obłonionych pęcherzyków zawierające kwaśne hydrolazy.

• Pęcherzyki zawierające enzymy rozkładające białka, kwasy nukleinowe, węglowodany i tłuszcze.

• Łącznie w lizosomach jest obecnych ok. 40 różnych hydrolaz.

• Obecność tych enzymów stwarza konieczność obłonienia lizosomów.

• W lizosomie zachodzi nie tylko proces trawienia komórkowego wchłoniętych pokarmów, ale także rozkład niepotrzebnych już cząsteczek.

• W lizosomach zachodzą procesy degradacji między innymi białek glikolipidów i sulfoglikolipidów oraz estrów wysokocząsteczkowych i estrów nieskocząsteczkowych.

• Substraty mające ulec degradacji w lizosomach, trafiają tam głównie na drodze endocytozy klatrynozależnej.

• Zdecydowana większość enzymów hydrolitycznych stanowią białka rozpuszczalne obecne w świetle lizosomów.

Białka ulegające proteolizie w lizosomach.

• wymagają aktywacji i napietnowania ubikwityną

• proces ich rozkładu zachodzi w wyspecjalizowanej, niebłonowej strukturze - proteosomie

Białka ulegające degradacji w lizosomach.

• nie wymagają naznaczenia ubikwityną

• trafiają do obłonionego przedziału - lizosom, drogą endocytozy

• są hydrolizowane z udziałem kwaśnych proteaz rozpuszczonych w macierzy lizosomów

• w lizosomoach degradowane są też inne niż białka cząsteczki

Transcytoza.

Pęcherzyki przechodzą z jednej strony błony na drugą. Zjawisko transportowania danej substancji z jednego bieguna komórki na drugi poprzez cytoplazmę. Z reguły substancja jest pobierana przy udziale receptora na jednym biegunie i transportowana w pęcherzykach wewnątrzcytoplazmatycznych. Po dotarciu pęcherzyka na drugi biegun komórki, błona pęcherzyka zlewa się z błoną komórkową, a substancja uwalnia się do otoczenia. Przykładem może być transport immunoglobulin A przez komórki nabłonkowe jelita.

Ważniejsze enzymy lizosomalne.

Nazwa enzymu	Substrat
Kwaśna fosfataza Arylosulfataza β α - Galaktozydyna β - Galaktozydyna Katepsyna L β - Glukuronidaza Heksaminidaza	Estry fosforanowe Estry siarczanowe Glikolipidy Gangliozydy Białka Mukopolisacharydy Glikozoaminoglikan

Proteoliza lizosomowa jest mniej selektywna niż cytozolowa.

Białka ulegają degradacji ponieważ.

• jest to radzaj regulacji ich aktywności biologicznej

• ulegają odnowie

• są źródłem aminokwasów dla nowopowstających białek

Zaburzenia związane z lizosomami.

• wynikające z braku enzymu (lizosomopatie)

• mukolipidoza II; brak enzymu odpowiadającego za fosforylację mannozy

• choroba Huntera (mukopolisacharydoza typu II (MPS II))

• MPS I (zespół Hurler) - niedobór α-L-iduronizazy

• MPS II (choroba Huntera) - niedobór sulfatazy iduronianu

• MPS III (choroba Sanfilippo) - sulfataza-N-heparanu

• spichrzenie - zaburzenie trawienia lizosomu

• choroba Gauchera - AD; brak glukcerebrazy w komórkach żernych

• kumulacja ceramidoglikozydów

• choroba Niemanna - brak sfingomielidazy i gromadzenie sfingomieliny

• choroba Taya i Sachsa - brak heksaaminidazy i gromadzenie gangliozyny GM2

• choroba Fabry'ego - ciężko u mężczyzn; brak ceramido-3-heksodynazy

• choroba Wolmana - brak kwaśnej lipazy i gromadzenie estrów glicerolu

• choroba Sapchoffa i Jatzkewitza - tak jak u Taya i Sachsa, gangliozydaza GM1 → niedorozwój umysłowy, zaburzenia kosci

• lipogranolomatoza Farbera - gromadzenie cerkulazy

• leukodystrofie metachromatyczna - metachromazja nerwów

• glikogenoza

• glikogenetyczne lizosomy - zmiany przy adaptacji komórek, jej ostre i przewlekłe uszkodzenia

Gromadzenie wewnątrzkomórkowe prowadzi do przewlekłych uszkodzeń komórkowych.

• astrocytoza - powstają ciałka resztkowe - w lizosomach zagęszczenie substancji białkowych

• autofagia - trawinie własnych struktur komórki; w warunkach fizjologicznych - zanik gruczołu po laktacji

• zanik pierwotny - brak energii w komórce - nie ma enzymów glikolitycznych

• zanik brunatny - w lizosomach gromadzenie się lipidów, białek, fosfolipidów z rozkładu cytoplazmy (przejaw wewnątrzkomórkowej martwicy)

Peroksysomy (mikrociałka).

• organella komórkowa o średnicy 0,2 - 1 mikrometra

• otoczone pojedynczą bloną białkowo-lipidową

• wnętrze wypełnia jednorodna macierz

• często zawierają inuluzje(?) krystalicznego białka

• peroksysomy to głównie frakcja mikrociał, w której zachodzi rozkład H₂O₂; stąd pochodzi nazwa tych organelli

• zaangazowane w procesy utleniania, stąd ich główny system enzymów tworzą ksydoreduktazy flawinowe i katalaza

• produktem ubocznym aktywności peroksydazy jest toksyczny H₂O₂

• Jego rozkład (H₂O₂) zapewnia katalaza bądź peroksydaza

Rola peroksysomów.

• detoksykacja komórek przez utlenianie metabolitów i ksenobiotyków

• rozkład nadtlenku wodoru

• oksydacja średniołańcuchowych i długołancuchowych kwsaów tłuszczowych do cząsteczek 8-węglowych (dalsze etapy zachodzą w mitochondriach)

• biosynteza estrolipidów, chlesterolu

• produkcja kwasów żólciowych

• przemiana kwasu moczowego do alantoiny (oksydaza moczanowa)

• metabolizm aminokwasów (alantoinian, gloksinian pierwszy)

Peroksysomy - pierwotne utleniacze:

• pęcherzyki o średnicy 0,5-1,5 mikrometra otoczone pojedynczą błoną

• występują w komórkach wątroby i nerek u ssaków, w fotosyntetyzujących komórkach roślinnych; wystęopują nielicznie w większości komórek

Wnętrze peroksysomu wypełnia elektronowo-gęsta ziarnista macierz, której rdzeń zwany jest nukleoidem. Strukturę tę stanowi krystaliczna postać oksydazy moczanowej (urykazy)

Organellum komórki eukariotycznej o średnicy 0,2-1,8 μm, otoczone jedną błoną, o kształcie owalnym bądź sferycznym. W komórce roślinnej peroksysomy znajdują się w bezpośrednim kontakcie z chloroplastami i mitochondriami i stykają się z powierzchniami ich błon.

U zwierząt występuje tylko jeden typ peroksysomu - zawierający enzym katalazę - uczestniczący w procesie neutralizacji szkodliwego nadtlenku wodoru.

Metabolizm H₂O.

RH₂ + O₂ →^{oksydacja, elektrony} R + H₂O₂

Droga rozkład katalitycznego:

2H₂O₂ →^katalaza O₂ + H₂O

Droga rozkład peroksydacyjnego:

RH₂ + H₂O₂ →^elektrony R + H₂O₂

Powstający w wyniku rozkładu H₂O₂ przez peroksydaza tlen zostaje wykorzystany do utlenienia np. alkoholi, azotanów, a energia powstała ulega rozproszeniu w postaci ciepła powstaje ATP.

β - oksydacja kwasów tłuszczowych

• przebiega w komórkach roślin, grzybów i zwierząt

• produktem jest acetylo - Co A

• w komórkach zwierzęcych proces ten zachodzi też w mitochondriach

• w komórkach zwierzęcych 25% do 50% rozkładu kwasów tłuszczowych zachodzi w peroksysomach

• dotyczy to kwasów tłuszczowych o długości łańcucha większej od 16 węgli

• kwasy o dłuższych łańcuchach (16-20 czy 24-26 węgli) również są rozkładane w peroksysomach

Metabolizm związków azotu.

Urikaza - oksydaza moczanowa przeprowadza w peroksysomach oksydację produktów przemiany kwasów nukleinowych (puryny) i niektórych białek.

W metabolizmie związków azotowych są też inne enzymy peroksysomowe - aminotransferazy - - ketokwasy. Peroksydazy biorąαprzenoszące grupy aminowe z aminokwasów na udział w biosyntezie i degradacji aminokwasów.

W metabolizmie związków niezwykłych np. D-aminokwasów albo ksenobiotyków (alkany). Oksydaza D-aminokwasowa jest być może dowodem, że peroksysomy są najstarszymi endosymbiontami.

Procesy patologiczne związane z zaburzeniami funkcji peroksysomów (peroksysomopatie):

• choroba Zellwegera (letalny zespół mózgowo-wątrobowo-nerkowy; zadka choroba metaboliczna spowodowana zaburzeniem funkcji peroksysomów co powoduje gromadzenie się w mózgu wielonienasyconych kwasów tłuszczowych o długości łańcucha C₂₆-C₃₈)

• ciężka kamica nerkowa

• adrenoleukodystrofia (choroba Siemerlinga-Creutzfeldta; Jest związana z zaburzoną peroksysomalną beta-oksydacją kwasów tłuszczowych o bardzo długich łańcuchach co prowadzi do nagromadzenia ich w różnych narządach)

Dysfunkcje dziedziczne = genetyczne:

• zaburzenia związane z nieprawidłową biosyntezą peroksysomów, które nie powstają np. kwasica hiperpi(?)tolowa

• choroba Zellwegera

• zaburzenia z dysfunkcją kilku enzymów - pozorny zespół Zellwegera, punktowa dysplazja chrząstek, karłowatość lizomielicznna

• defekt jednego enzymu - niedobór enzymu dwufunkcjonalnego, rzekomy zespól Zellwegera, katalaremia

Hipotezy powstawania peroksysomów.

1. „pączkowanie: błony gładkiej ER

2. podział już istniejących peroksysomów

Najbardziej prawdopodobna jest hipoteza druga, bo białka peroksysomów są syntetyzowane na polisomach cytosolowych i importowane do już powstałych mikrociał.

Transport białek.

• Białka są dostarczane potranslacyjnie.

• Ich transport odbywa się z zużyciem ATP.

• Muszą być wyposażone w trzyliterowy sygnał targetu - sekwencja SKL.

• Jest ona zbudowana z 3 aminokwasów: small uncharged - seryna, prolina, alanina; kation charged - lizyna

Pozbawienie sygnału SKL pozostawia białko perosysomowe w cytozolu. Dołączenie do obcego bialka - wprowadza je do peroksysomu (uniwersalizm SKL). Uniwersalizm dotyczy białek pochodzących z innych organizmów. Jako przykład może służyć zlokalizowana w peroksysomach lucyferaza. Jest ona do nich transportowana w komórkach świetlików i transgenicznych roślin (tytoń).

Ważniejsze enzymy peroksysomów zwierzęcych.

Enzym	Proces
Oksydaza moczanowa Oksydaza D-aminokwasów Acetylo CoA Acetylotransferaza karnityny Reduktaza 3-hydroksy-3-metyloglutaryulo-CoA	Katabolizm puryn Utlenianie aminokwasów Utlenianie kwasów tłuszczowych Transport kwasów tłuszczowych Synteza cholesterolu

________________________________________________________________________________

Odkrywcą peroksysomów jest Christian de Duve.

Peroksysomy różnią się od lizosomów wrażliwością na inny detergent - digitoninę - 10 razy więcej digitoniny trzeba aby wyzwolić katalazę niż kwasnę fosfatazę. Gdyby były zlokalizowane w tych samych pęcherzykach - wyzwalałoby je to samo stężenie digitoniny.

Gdy zawierają rdzeń krystaliczny - łatwo je odróżnić na zdjęciach TEM. Gdy go nie ma stosuje się test DAB (reakcja z diaminobenzydyną).

W reakcji DAB po utlenieniu diaminobenzydyny przez katalazę powstaje polimer łączący się z czterotlenkiem osmu.

---