Pracownia 14

Własności chemiczne aminokwasów i białek. Chromatografia cienkowarstwowa. Kolorymetryczne oznaczenie stężenia białka

Cel ćwiczenia:

- analiza jakościowa aminokwasów,

- analiza jakościowa i ilościowa białka.

Aminokwasy

Reakcja z kwasem azotowym(III)

1. Szczyptę aminokwasu rozpuścić w 1 ml rozcieńczonego roztworu kwasu octowego.

2. Dodać szczyptę azotanu(III) sodu.

Wynik:

Z probówki wydziela się azot.

Równanie reakcji

Reakcja z siarczanem(VI) miedzi(II)

1. Szczyptę aminokwasu rozpuścić w 1 ml wody.

2. Dodać roztworu CuSO₄.

Wynik:

Aminokwasy tworzą związki kompleksowe z miedzią o barwie ciemnoniebieskiej.

Reakcja z ninhydryną

1. Szczyptę aminokwasu rozpuścić w 1 ml wody.

2. Dodać kilka kropli 0,2% roztworu ninhydryny.

3. Ogrzać probówkę na łaźni wodnej.

Wynik:

Pojawia się ciemnofioletowe zabarwienie.

Równanie reakcji

Reakcja ksantoproteinowa dla aminokwasów aromatycznych

1. Do probówki zawierającej 2 ml roztworu aminokwasu dodać 1 ml stężonego HNO₃.

2. Ogrzać na łaźni wodnej.

3. Po oziębieniu zalkalizować 20% roztworem NaOH.

Wynik:

Powstaje żółte zabarwienie i ewentualnie żółty osad, jeśli badana próba zawierała aminokwas aromatyczny (tyrozyna, tryptofan, fenyloalanina). Po dodaniu roztworu NaOH obserwuje się pogłębienie barwy lub jej zmianę na kolor pomarańczowy.

Przykładowe równanie reakcji

Reakcja na obecność aminokwasu zawierającego siarkę

1. Do probówki zawierającej 1 ml roztworu aminokwasu dodać 2 ml 20% roztworu NaOH.

2. Następnie dodać 2-5 kropli stężonego roztworu octanu ołowiu(II).

3. Ogrzać w łaźni wodnej do wrzenia.

Wynik:

Powstaje czarny osad siarczku ołowiu, jeśli badana próba zawierała cysteinę lub metioninę.

Przykładowe równanie reakcji

CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA AMINOKWASÓW

1. Przygotować dwie płytki chromatograficzne. Na płytkach (rysunek) ołówkiem zaznaczyć linię startu (1,5 cm od brzegu płytki). Na lini startu zaznaczyć punkty.

2. Za pomocą kapilary nanieść w zaznaczonych punktach wzorce (aminokwasy) i mieszaninę. Po naniesieniu prób plamki suszyć strumieniem ciepłego powietrza z suszarki.

3. Płytki wstawić pionowo do dwóch komór chromatograficznych zawierających odpowiednie eluenty:

- aceton:kwas octowy:woda zmieszane w stosunku objętościowym 30:1:20

- 1-propanol:kwas octowy:woda zmieszane w stosunku objętościowym 4:1:1.

Rozwijanie chromatogramów prowadzić do osiągnięcia przez czoło rozpuszczalnika wysokości 1,5 - 2 cm od górnej krawędzi płytki.

4. Płytki wysuszyć. Spryskać roztworem ninhydryny. Ogrzać strumieniem gorącego powietrza do pojawienia się zabarwionych plamek aminokwasów.

5. Uwidocznione plamki obrysować ołówkiem, wyznaczyć środek plamki i zmierzyć odległość od miejsca startu do środka plamki (a), oraz drogę przebytą przez rozpuszczalnik (x).

6. Obliczyć wartości współczynników R_f dla wszystkich aminokwasów i mieszaniny.

Białka

Reakcja biuretowa

1. Do 1 ml roztworu białka dodać 1 ml 2-molowego roztworu NaOH.

2. Następnie dodać kilka kropli 1% roztworu CuSO₄.

Wynik:

Roztwór zmienia barwę z jasnoniebieskiej na intensywny fioletowy kolor. Zmiana jest wywołana powstawaniem złożonych związków kompleksowych, w których jon Cu²⁺ kompleksowany jest przez minimum dwie grupy peptydowe.

Reakcja z ninhydryną

1. Do 1 ml roztworu białka dodać kilka kropli 0,2% roztworu ninhydryny.

2. Ogrzać probówkę na łaźni wodnej.

Wynik:

Pojawienie się ciemnofioletowego, niebieskiego lub purpurowego zabarwienia wskazuje na obecność białka.

Reakcja ksantoproteinowa

1. Do probówki zawierającej 2 ml roztworu białka dodać 1 ml stężonego HNO₃.

2. Ogrzać na łaźni wodnej.

3. Po oziębieniu dodać 1 ml 20% roztworu NaOH.

Wynik:

Powstaje żółte zabarwienie i ewentualnie żółty osad. Po dodaniu roztworu NaOH obserwuje się pogłębienie barwy lub jej zmianę na kolor pomarańczowy.

Pozytywny wynik reakcji uwarunkowany jest obecnością w białku aminokwasów zawierających pierścień aromatyczny (fenyloalanina, tryptofan, tyrozyna), które ulegają nitrowaniu, tworząc produkty o żółtym zabarwieniu.

Reakcja cystynowa

1. Do probówki zawierającej 2 ml roztworu białka dodać 2 ml 20% roztworu NaOH.

2. Następnie dodać 2-5 kropli stężonego roztworu octanu ołowiu(II).

3. Ogrzać na łaźni wodnej do wrzenia.

Wynik:

Zawartość probówki przyjmuje brunatno czarne zabarwienie osadu siarczku ołowiu.

Pozytywny wynik reakcji uwarunkowany jest obecnością w białku aminokwasów zawierających siarkę (cysteina, metionina).

Reakcje wytrącania

1. Do probówek zawierającej ok. 1 ml roztworu białka wlać po 1 ml odczynnika strącającego:

Nr 1: stężonego kwasu mineralnego,

Nr 2: soli metalu ciężkiego (CuSO₄, (CH₃COO)₂Pb, HgCl₂, AgNO₃ i inne),

Nr 3: alkoholu lub acetonu,

Nr 4: stałego NaCl lub (NH₄)₂SO₄.

2. Do powstałego osadu dodać kroplami wodę destylowaną.

Wynik:

W probówkach nr 1-3 białko ulega reakcji koagulacji nieodwracalnej (denaturacja). W probówce nr 4 zachodzi proces wysalania (koagulacja odwracalna).

Oznaczanie stężenia białka metodą kolorymetryczną (biuretową)

1. Z 2,5% roztworu białka przygotować roztwory wzorcowe wg poniższej tabeli.

Próba	Roztwór wzorcowy białka [ml]	Woda [ml]
0 - próba ślepa	0	0,50
1.	0,05	0,45
2.	0,10	0,40
3.	0,15	0,35
4.	0,20	0,30
5.	0,25	0,25

2. W szóstej probówce znajduje się 0,5 ml badanej próby białka o nieznanym stężeniu.

3. Do wszystkich probówek dodać po 2 ml odczynnika biuretowego (alkalicznego roztworu siarczanu(II) miedzi w winianie potasowo-sodowym) i odstawić na 20 minut.

4. Po tym czasie zmierzyć absorbancję badanych próbek wobec próby ślepej (probówka nr 0) przy długości fali 540 nm.

Próba	Wartość absorbancji	Ilość białka w probówce [mg]
0 - próba ślepa
1
2
3
4
5
6 - badana próba

5. Z przygotowanych roztworów wzorcowych wykreślić krzywą wzorcową - zależność absorbancji
w funkcji ilości białka [mg]. Do obliczeń przyjąć gęstość roztworu białka 1 g/ml.

6. Z krzywej wzorcowej odczytać ilość białka w badanej próbie.

7. Obliczyć stężenie białka w g/100 ml.

Analiza jakościowa aminokwasów

1. Uzupełnij tabele.

2. Na podstawie wyznaczonych wartości współczynników retencji zidentyfikować składniki mieszaniny.

Aminokwas	HNO2	CuSO4	Reakcja z ninhydryną	Stężony HNO3	(CH3COO)2Pb	NaHCO3
Glicyna
Kwas asparaginowy
Tyrozyna
Cysteina

Aminokwas	Rf
Glicyna
Kwas asparaginowy
Tyrozyna
Cysteina
Mieszanina:

---