WYKŁAD 15

BLOTTING

Elektrotransfer jest przenoszony na membrany:

• nitrocelulozowe

• nylonowe

• PVDF

• transfer DNA

• transfer RNA

• transfer białek

Białka rozkładamy na żelu, przykładamy membranę i wszystko przechodzi na membranę, a żel pozostaje czysty. Transfer jest kompletny jak żel będzie całkowicie czysty.

Po transferze następuje detekcja.

• barwienie Coomasie Brillant Blue, Ponceau S

• reakcje specyficzne ze znakowanymi enzymami przeciwciałami i przeprowadzenie reakcji barwnej

• reakcje z przeciwciałami znakowanymi izotopami - autoradiografia

• hybrydyzacja kwasów nukleinowych /sondy-autoradiografia, fluorescencja/

Detekcja immunologiczna białek metodą Western Blot

Mieszanie białek, barwienie na membranie powstają prążki inkubacja z przeciwciałami przeciwciała przyłączają się do jednego, konkretnego białka powinniśmy zobaczyć tylko jeden prążek

Metoda ta pozwala na identyfikację konkretnego białka.

Immunodetekcja białek - reakcje specyficzne z przeciwciałami

• Immunoglobuliny znakowane enzymami [HRP,AP] - reakcja barwna

• chemiluminiscencja, chemifluorescencja, bioluminescencja - przeciwciała znakowane są enzymem, który przeprowadza taką reakcję w wydzieleniem światła

• Immunoglobuliny znakowane izotopami - autoradiografia

• Immunoglobuliny znakowane Au

Detekcja kwasów nukleinowych

• hybrydyzacja - kwasy nukleinowe denaturuje się do postaci jednoniciowej, tworzą się krótkie odcinki komplementarne do danej sekwencji. Odcinki komplementarne są ze znacznikiem - może to być izotop, barwnik fluorescencyjny, biotyna.

• detekcja - autoradiografia, fluorescencja, detekcja immunologiczna

ELEKTROFOREZA KAPILARNA

- w większości przypadków swobodna (nie zawsze)

Budowa:

• źródło wysokiego napięcia (0-30kV)

• dwa pojemniki z buforem

• dwie elektrody

• kapilara

• system dozowania próbek

• detektor - UV-Vis, fluorescencyjne, MS, elektrochemiczne, NMR

Kapilara - rurka krzemionkowa z otoczką poliamidową; średnica, od 20 do 100 mikrometrów, 50 mikrometrów - najbardziej popularna; długość - 20-100 cm

Przepływ elektroosmotyczny

-ścianki - ładunek ujemny

- wnętrze - ściana ładunków dodatnich

Kiedy przykładamy napięcie następuje cały ruch cieczy wymuszony obecnością chmury kationów i wszystkie jony płyną do katody. W detektorze pojawiają się najpierw kationy, potem jony neutralne a na końcu aniony.

Wprowadzanie próbek

• najczęściej nadciśnienie wpycha płyn do wnętrza

• podciśnienie z 2 strony, które wciąga

• różnica poziomów w naczynkach

• wprowadzanie rurki za pomocą prądu - ryzyko, że nie wszystkie składniki przejdą do kapilary.

Optymalizacja metody rozdziału -Nieograniczone pole manewru, można wybierać różne metody i parametry:

• średnica wewnętrzna kapilary

• długość kapilary

• skład buforu

• napięcie

• temperatura

• detekcja

Warianty elektroforezy kapilarnej:

• kapilarna elektroforeza strefowa - szybkość migracji jonów to wypadkowa ich stosunku ładunku do masy cząsteczek. Składniki poruszają się z różną prędkością pod wpływem przyłożonego napięcia. Metoda ta pozwala na rozdzielenie substancji drobno i wielkocząsteczkowych.

• izoelektryczne ogniskowanie - nakładamy próbkę, następuje zogniskowanie na całej długości kapilary. Po zogniskowaniu wywiera się ciśnienie na kapilarę, aby prążki przemieścić do detektora i umożliwić odczytanie. Składniki kapilary rozdzielane są w gradiencie pH wytwarzanym we wnętrzu kapilary, poruszając się pod wpływem przyłożonego napięcia do momentu osiągnięcia strefy pH odpowiadającej punktowi izoelektrycznemu danej substancji. Rozdziela się związki o charakterze amfoterycznym.

• żelowa elektroforeza kapilarna - można rozdzielać cząsteczki ze względu na ich różnicę wielkości. Rozdział zachodzi w kapilarze wypełnionej żelem o odpowiedniej średnicy porów, w której szybkość migracji makromolekuł zależy od wielkości ich cząsteczek. Możliwy jest rozdział kwasów nukleinowych, oligonukleotydów, peptydów i białek.

• izotachoforeza kapilarna - 2 rodzaje elektrolitów: wiodący - jony bardzo szybko poruszając się i opóźniony: jony o niskiej ruchliwości. Próbkę wprowadza się pomiędzy dwa elektrolity. Po przyłożeniu napięcia jony wędrują za buforem „wiodącym” według malejącej ruchliwości. Składniki próbki dzielą się na jony, które szybciej i wolnej się wydzielają. Kolejność wydzielania: najpierw jony chlorkowe, potem białka i na końcu jony cynowe.

• micelarna chromatografia elektrokinetyczna - do buforu dodajemy detergentu (surfaktant - środek powierzchniowo czynny) w stężeniu, które przekracza krytyczne stężenie micelacji. Tworzą się micele- hydrofilowe grupy układają się na zewnątrz miceli, hydrofobowe - wewnątrz. Składniki próbki dzielą się ze względu na stopień hydrofobowości. Po przyłożeniu prądu następuje przepływ elektroosmotyczny do ujemnej elektrody. Micele na zewnątrz mają ładunek ujemny, części hydrofobowe z micelami będą opóźnione w stosunku do cząsteczek rozpuszczonych. Najwcześniej otrzymamy cząsteczki rozpuszczone i neutralne, a potem micele - najdłuższy czas retencji mają te cząsteczki hydrofobowe przyłączone do miceli.

• elektrochromatografia kapilarna - kolumna chromatograficzna kapilarna, wypełniona fazą stacjonarną. Oddziałują części hydrofobowe. Przepływ jest wymuszony, przy użyciu prądu. Zjonizowane części niehydrofobowe bardzo szybko przejdą przez kapilarę. W przypadku analitów obdarzonych ładunkiem, wykorzystywana jest również ich ruchliwość w polu elektrycznym.

Zastosowania

- analiza różnych jonów - aniony, kationy

- analiza leków

- analiza białek, węglowodanów, kwasy nukleinowe itp.