Otrzymanie surowego preparatu enzymatycznego (inwertazy) z drożdży i zastosowanie go do hydrolizy sacharozy

Materiały:

- drożdże piekarskie

- 0.1 M bufor octanowy o pH 4.7

- 7% roztwór sacharozy

- 1 M roztwór NaOH

- odczynnik Benedicta

1. 2.5 g drożdży ucierać w moździerzu z piaskiem i 25 ml wody destylowanej.i odstawić na 30 minut.

2. Do 2 probówek wirówkowych pobrać po 5 ml zawiesiny i odwirować (4000 rpm, 10 min).

3. 1 ml otrzymanego supernatantu (zawierającego inwertazę) umieścić w probówce, a następnie dodać 2 ml 0.1 M buforu octanowego o pH 4.7 i 2 ml 7% roztworu sacharozy. Zawartość probówki wymieszać.

4. Do kolejnej probówki odmierzyć 0.5 ml mieszaniny (przygotowanej w pkt. 3) i od razu zalkalizować wobec papierka wskaźnikowego, dodając kroplami 1 M roztwór NaOH (próba kontrolna). Oznaczyć w próbie kontrolnej poziom cukrów redukujących metodą Benedicta.

5. Pozostałą część mieszaniny otrzymanej w punkcie 3 inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut (mieszanina reakcyjna).

6. Po upływie czasu inkubacji, pobrać do kolejnej probówki 0.5 ml mieszaniny reakcyjnej i zalkalizować (jak w pkt. 4), dodając kroplami 1 M roztwór NaOH. Oznaczyć w mieszaninie reakcyjnej poziom cukrów redukujących metodą Benedicta.

Metoda Benedicta:

• Do 3 probówek zawierających odpowiednio:

1. mieszaninę otrzymaną w punkcie 4 (próba kontrolna)

2. mieszaninę otrzymaną w punkcie 6 (próba właściwa)

3. 0.5 ml wody destylowanej

dodać po 5 ml roztworu Benedicta i wymieszać zawartość każdej probówki

• Probówki inkubować przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 95ºC.

• Na podstawie uzyskanych wyników ocenić przebieg reakcji hydrolizy substratu.