Otrzymanie surowego preparatu enzymatycznego (inwertazy) z drożdży i zastosowanie go do hydrolizy sacharozy
Materiały:
- drożdże piekarskie
- 0.1 M bufor octanowy o pH 4.7
- 7% roztwór sacharozy
- 1 M roztwór NaOH
- odczynnik Benedicta
2.5 g drożdży ucierać w moździerzu z piaskiem i 25 ml wody destylowanej.i odstawić na 30 minut.
Do 2 probówek wirówkowych pobrać po 5 ml zawiesiny i odwirować (4000 rpm, 10 min).
1 ml otrzymanego supernatantu (zawierającego inwertazę) umieścić w probówce, a następnie dodać 2 ml 0.1 M buforu octanowego o pH 4.7 i 2 ml 7% roztworu sacharozy. Zawartość probówki wymieszać.
Do kolejnej probówki odmierzyć 0.5 ml mieszaniny (przygotowanej w pkt. 3) i od razu zalkalizować wobec papierka wskaźnikowego, dodając kroplami 1 M roztwór NaOH (próba kontrolna). Oznaczyć w próbie kontrolnej poziom cukrów redukujących metodą Benedicta.
Pozostałą część mieszaniny otrzymanej w punkcie 3 inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut (mieszanina reakcyjna).
Po upływie czasu inkubacji, pobrać do kolejnej probówki 0.5 ml mieszaniny reakcyjnej i zalkalizować (jak w pkt. 4), dodając kroplami 1 M roztwór NaOH. Oznaczyć w mieszaninie reakcyjnej poziom cukrów redukujących metodą Benedicta.
Metoda Benedicta:
Do 3 probówek zawierających odpowiednio:
mieszaninę otrzymaną w punkcie 4 (próba kontrolna)
mieszaninę otrzymaną w punkcie 6 (próba właściwa)
0.5 ml wody destylowanej
dodać po 5 ml roztworu Benedicta i wymieszać zawartość każdej probówki
Probówki inkubować przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 95ºC.
Na podstawie uzyskanych wyników ocenić przebieg reakcji hydrolizy substratu.