Natalia Maciejewska, Paulina Rusinek, Aleksandra Smędzik gr. Pon. 12.15

1. Wyznaczanie stałej Michaelisa dla arylosulfatazy A (EC 3.1.6.1).

Cel : Arylosulfatazy są enzymami katalizującymi in vitro hydrolizę estrów siarczanowych fenoli wg następującej reakcji :

R-O-SO₃H + H₂O -> R-OH + SO₄^2- +H⁺

Celem ćwiczenia było wykreślenie krzywej Michaelisa dla enzymu arylosulfataza A.

- W probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml sporządzono mieszaninę reakcyjną zawierającą 0,6 ml homogenatu wątroby, 0,6 ml substratu i 0,6 ml 0,5M buforu octanowego pH 5,0 zawierającego 10% NaCl

- Mieszaninę inkubowano w temp. 37^oC

- Po czasie 2, 4, 6, 8, 10 min. Pobrano po 300 mikrolitrów i przeniesiono do uprzednio przygotowanych probówek zawierających 1ml 0,5M NaOH

- Po wymieszaniu zmierzono absorbancję przy 515nm na spektrofotometrze względem ślepej odczynnikowej

- Ślepą odczynnikową przygotowano dodając do 100 mikrolitrów 0,5M buforu octanowego pH 5,0 zawierającego 10% NaCl 100mikrolitrów substratu i 100mikrolitrów H₂O

-Ślepą odczynnikową inkubowano w temp. 37^oC i po 5min. Dodano 1ml 0,5M NaOH.

-Opisane oznaczenie wykonano dla 6 różnych stężeń substratu w zakresie od 20 do 120 mg/ml.

Otrzymano następujące wyniki:

Tabela 1. Wartość absorbancji w zależności od stężenia substratu oraz czasu trwania reakcji enzymatycznej.

Czas [min]	2	4	6	8	10
Stężenie [mg/10ml]	Absorbancja
20mg/10ml	0,082	0,097	0,098	0,104	0,119
40mg/10ml	0,070	0,114	0,140	0,163	0,206
60mg/10ml	0,111	0,138	0,172	0,211	0,265
80mg/10ml	0,121	0,169	0,216	0,275	0,338
120mg/10ml	0,139	0,201	0,298	0,355	0,442

Wiedząc, że:

1μmol katecholu ma absorbancję 3,2 dla objętości próbki 1,3ml

Przeliczono korzystając z proporcji ile μmol produktu znajduje się w każdej z badanych prób.

Tabela 2. Ilość wydzielonego produktu w μmol w zależności od stężenia substratu i czasu trwania reakcji enzymatycznej.

Czas [min]	2	4	6	8	10
Stężenie [mg/10ml]	μmol Produktu
20mg/10ml	0,0256	0,0303	0,0306	0,0325	0,0371
40mg/10ml	0,0219	0,0356	0,0438	0,0509	0,0644
60mg/10ml	0,0347	0,0431	0,0538	0,0659	0,0828
80mg/10ml	0,0378	0,0528	0,0675	0,0859	0,1056
120mg/10ml	0,0434	0,0628	0,0931	0,1109	0,1381

Dla każdego stężenia substratu przedstawiono graficznie ilość uzyskanego produktu:

Wykres 1. Ilość uzyskanego produktu w zależności od czasu (stężenie substratu 20mg/10ml)

Wykres 2. Ilość uzyskanego produktu w zależności od czasu (stężenie substratu 40mg/10ml)

Wykres 3. Ilość uzyskanego produktu w zależności od czasu (stężenie substratu 60mg/10ml)

Wykres 4. Ilość uzyskanego produktu w zależności od czasu (stężenie substratu 80mg/10ml)

Wykres 5. Ilość uzyskanego produktu w zależności od czasu (stężenie substratu 120mg/10ml)

Następnie nałożono na siebie wszystkie wykresy:

Wykres 6. Ilość uzyskanego produktu w zależności od czasu.

Wykres 7. Wyznaczenie graficzne Stałej Michaelisa

Wzory:

A

V₀ = A_3,2 * M₂₃₅* T_[min]

Gdzie:

1. Pomiar absorbancji dla danego stężenia i czasu

A_3,2 - absorbancja 1μmol katecholu

M₂₃₅ - Masa molowa czasteczki produktu

T - czas reakcji [min]

Wzor na Stałą Michaelisa

• Wniosek z ćwiczenia : Im dłużej zachodziła reakcja enzymatyczna w roztworze, tym więcej cząsteczek substratu zostało rozłożonych i uwalniany został 4-nitrokatechol oznaczany spektrofotometrycznie przy długości fali 515nm.