Patomorfologia 20.04.2010r.

Temat: Krojenie skrawków.

1. Mikrotom histologiczny - do cięcia preparatów zatopionych w parafinie i żywicach akrylowych

W mikrotomie saneczkowym porusza się nóż, w rotacyjnym - preparat. Mikrotom rotacyjny jest lepszy niż saneczkowy.

Zasada działania:

1. przesuwanie preparatu (np. bloczka parafinowego) względem noża m. rotacyjny

2. przesuwanie noża względem preparatu m. saneczkowy

Wyróżniamy też mikrotomy automatyczne, np. mikrotom automatyczny z przystawką mrożącą

* żywice akrylowe są lepsze do zatapiania niż parafina gdyż są twardsze i dzięki temu możemy cieniej kroić preparat.

* z bloczka parafinowego - skrawki 1 - 2 μm

* przy żywicach akrylowych skrawek 0,5 μm to już gruby skrawek, gdyż możliwe jest otrzymanie skrawków rzędu wielkość nm

* kąt noża musi być taki, aby równomiernie ścinać zatopiony materiał

2. Rodzaje noży w mikrotomach:

1. stalowe - tylko dla skrawków z kriostatu oraz materiału zanurzonego w parafinie

2. szklane - dla materiału zatopionego w żywicy - kroi się tym nożem skrawki półcienkie 0,5 μm

3. diamentowe - histologiczne tną materiał zatopiony w parafinie, a także istnieją noże diamentowe do kriostatów (noże te nie tępią się, chyba, że zła prędkość w mikrotomie automatycznym, nieodpowiedni kąt cięcia i grubość)

tkanki:

półcienie 0,5 μm

ultracienkie 30nm

trymowanie - wycina się prostokąty lub trapezy wokół materiału tak aby skrawek był mały, podczas ścinania tej samej wielkości; w przypadku materiału świeżego lub parafinowego trymowanie to proces ścinania materiału/bloczku do momentu aż uwidocznimy całą tkankę.

3. Szkiełka podstawowe

• uzyskane skrawki umieszcza się na powierzchni wody, której temperatura jest nieco niższa nić temp. topnienia parafiny.

• do barwienia H&E używa się skrawków grubości 5 - 6 μm

• do barwienia H&E używa się szkiełek oczyszczonych i odtłuszczonych, na których umieszcza się skrawki

Jak odtłuścić szkiełko podstawowe?

Umyć detergentem z wodą woda destylowana umieścić na noc w alkoholu 95-96%

• oprócz barwienia H&E na tych szkiełkach podstawowych możemy wykonywać barwienia, które nie wymagają długiego czasu preparatyki

• czasem skrojone skrawki parafinowe naklejane są na szkiełka podstawowe pokryte:

- silanem

- poli - L - lizyną

- biobondem

- rzadziej nabiałkowane (już się niestosuje gdyż wyniki reakcji wychodziły zafałszowane, z powodu łączenia się antygenów nie tylko z materiałem badanym, ale także białkiem użytym do nabiałkowania szkiełka podstawowego)

Wymienione substancje zwiększają adhezyjność szkiełka. Szkiełka o podwyższonej adhezyjności stosuje się do reakcji immunohistochemicznych, barwień specjalnych i reakcji hybrydyzacji.

* trwałe przyklejenie skrawka otrzymuje się przez ogrzewanie gotowych preparatów w temp. 50^oC przez kilka godzin (zwykle wystarczy czas od 40min do godziny)

* suszenie skrawków następuje poprzez odparowanie wody

* preparaty parafinowe maksymalne grubości:

- do barwienia H&E 6μm

- do immunohistochemicznych rekacji 4μm

- do hybrydyzacji in- situ 1-2μm

4. Materiał nieutrwalony - czyli do badania śródoperacyjnego

- mrożony w kriostacie (-30 ^oC , -40 ^oC )

- mrożony CO₂ - suchy lód ( -60 ^oC )

- mrożony ciekłym azotem ( - 180 ^oC , -195 ^oC )

* im bardziej utrwalony materiał, tym cieńsze skrawki później możemy otrzymać.

* tkankę pobraną do badania śródoperacyjnego należy zamrozić a następnie skrawać przy użyciu mikrotomu zwanego kriostatem mikrotom rotacyjny z komorą mrożącą

* szkiełka, na które będziemy nakładać skrawki również muszą być zmrożone, w przeciwnym razie z materiału zrobi nam się `ciapka'

( w przypadku materiałów zatopionych w żywicach syntetycznych otrzymujemy skrawki półcienie lub ultracienkie, a do cięcia stosujemy noże szklane lub diamentowe)

Temat: Techniki barwienia

1. Przygotowanie do barwienia usunięcie parafiny i uwodnienie tkanki.

Po wykonaniu preparatów z materiału zatopionego w postaci bloczków parafinowych należy przygotować je do barwienia.

1. Odparafinowanie skrawków

2. Uwodnienie tkanek - konieczne, gdyż barwniki są rozpuszczalne w wodzie i nie mogą przeniknąć przez parafinę przepajając tkankę.

I etap

Odparafinowanie skrawków: skrawki naklejone na szkiełka podstawowe poddajemy:

• wstępnej deparafinizaacji w temp. 60 ^oC przez noc

• ostatecznej deparafinizacji w:

- ksylen I (30min, 60 ^oC)

- ksylen II

- ksylen III

- ksylen IV

II etap

Uwodnienie

• alkohol 99,8% (2-3 min)

• 
  alkohol 96% alkohol 50% (2-3min w każdym)

• woda destylowana (2-5min)

III etap

Barwienie

• barwnik

2. Barwienie podstawowe H&E <hematoksylina & eozyna>

Jest to barwienie przeglądowe pozwalające ocenić całość struktury tkanki, poprzez kontrastowe zabarwienie cytoplazmy i jąder komórkowych.

Hematoksylina - substancja naturalna, zasadowa, barwiąca jądra kom. na kolor fioletowy do niebieskiego

Eozyna - substancja syntetyczna, kwaśna, barwiąca cytoplazmę na różowo - do czerwonego

Barwienie H&E:

* od alkoholi rozpoczyna się proces `zamykania' preparatu

* barwienie kończy się gdy wypłukujemy eozynę wodą destylowaną

* balsam kanadyjski nie rozpuszcza się w wodzie, jedynie w ksylenach, dlatego konieczne jest ponowne odwodnienie tkanki

* gdy preparat zamykamy w glicerynie - zaraz po barwieniu nanosimy kroplę gliceryny, nie musimy odwadniać tkanki, ponieważ gliceryna rozpuszcza się w wodzie

* minusem gliceryny jest to, że taki preparat nie jest trwały, zaletą np. fakt, że w przeciwieństwie do alkoholi nie rozpuszcza tłuszczy, dlatego też, gdy badamy tłuszcze preparat zamykamy gliceryną

Barwienie H&E:

Barwienie I	hematoksylina	3min
Płukanie	woda bieżąca woda destylowana	10 - 15min 2x 1min
Barwienie II	eozyna	3min
Płukanie	woda bieżąca woda destylowana	5min 1x 1min
Odwodnienie	alkohol 80% alkohol 90% alkohol 96% alkohol 99,8% aceton	3min 5min
Prześwietlenie	ksylen I ksylen II ksylen III	3min
Zamknięcie w medium	balsam kanadyjski

3. Metody barwienia służą do:

• wykrywania określonych elementów kom. i poszczególnych typów tkanek (H&E)

• lokalizacji substancji chemicznych występujących w tkankach (metody specjalne)

• na wykrywanie w tkankach antygenów za pomocą znakowanych przeciwciał

• identyfikacji złożonych aberracji struktury chromosomów, dodatkowego materiału chromosomowego, chromosomów markerowych, diagnostyki aneuploidii chromosomowych (ogólnie mówiąc do identyfikacji poziomu ekspresji genów, obecności aberracji chromosomowych z użyciem sond molekularnych w odpowiedni sposób znakowanych, aby możliwa była ich wizualizacja pod odpowiednim typem mikroskopu

4. Wybór metod barwienia zależy od:

• rodzaju materiału biologicznego

• rodzaju utrwalacza

• sposobu zatopienia skrawków

* należy pamiętać aby wybrane metody barwienia były metodami swoistymi

5. Metody barwienia

1. barwienie pojedyncze - użyty tylko jeden barwnik

2. barwienie złożone - dwa lub więcej barwników (barwniki mogą być używane jednocześnie lub kolejno

6. Rodzaje metod barwienia

1. cytologiczne (barwienie Papanicolau)

cel: szczegółowe zbadanie struktur wewnątrz komórkowych, np. mitochondriów, jądra kom, ap. Golgiego

2. cyto-histochemiczne

metoda uwidaczniająca w komórkach i tkankach określone substancje chemiczne - glikogen, tłuszcze, RNA, DNA; spełnia warunek swoistości

3. immunohistochemiczne

metoda pozwalająca na wykrywanie obecności substancji w tkankach o charakterze antygenów za pomocą znakowanych przeciwciał. Są różne znaczniki, najważniejsze to:

- peroksydaza chrzanowa - brązowy barwny produkt

- alkaliczna fosfataza - barwa niebieska produktu reakcji

Ogólnie enzym + substrat barwny produkt (wynik reakcji ogląda się pod mikroskopem świetlnym)

4. immunofluorescencja

metoda podobna do pkt `c', czyli wykrywanie specyficznych białek lub antygenów w tkance, lecz zamiast peroksydazy chrzanowej i alkalicznej fosfatazy, znakujemy fluorochromem. Wynik reakcji oglądamy pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym.

( Fluorochromy w zależności od rodzaju światła z palety barw światła białego świecą na określony kolor. Mikroskop fluorescencyjny świeci nam wycinkiem światła białego, np. barwą czerwoną, zieloną, UV itd. Źródło światła - lampa rtęciowa. Daną długością fali wzbudzamy fluorochromy - obserwujemy później w obrazie mikroskopowym czarne tło i różne kolory cząsteczek fluorescencyjnych.

W mikroskopie konfokalnym - ta sama zasada działania, ale zamiast lampy rtęciowej mamy laser. Laser tnąc preparat na warstwy tworzy obrazy plastrów i każdy plaster komórki możemy oglądać oddzielnie, dzięki czemu widzimy przestrzenny obraz)

5. fluorescencyjna hybrydyzacja In situ (FISH)

In situ - łac. na miejscu

Szerokie zastosowanie w badaniach cytogenetycznych, określenie poziomu ekspresji genów w tkankach, komórkach, z użyciem sond molekularnych (te sondy to krótkie fragmenty DNA/RNA) i różnych znaczników, np.

- chromogeny - purourowe odcienie

- peroksydaza chrzanowa i alkaliczna fosfataza

- fluorochromy - oglądane pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym (FISH)

- znakowanie srebrem (SISH)

- znakowanie złotem koloidalnym - do mikroskopii elektronowej

7. Barwienia specjalne

(histopatologiczne: np. Giemzy, Wrighta, Wrighta - Giemzy, PASS)

8. Barwienie progresywne i regresywne (wsteczne)

a) barwienie progresywne - skrawki w barwniku inkubuje się do momentu odpowiedniego zabarwienia preparatu ( np. H&E)

b) barwienie regresywne (wsteczne) - skrawki należy najpierw przebarwić danym barwnikiem, a następnie odbarwić, czyli różnicuję się zabarwienie w płynie różnicującym (np. barwienie Papanicolau, barwienie hematoksyliną żelazistą wg Heidenheina).

Odbarwianie w barwieniu regresywnym różnicowanie

* impregnowanie - polega na odkładaniu się srebra metalicznego. . .

* metachromazja - pewne składniki tkanki barwią się na inny kolor niż kolor użytego barwnika, np. zmiany powstające w przebiegu skrobiawicy (Amyloidozy), w tkance barwią się na kolor czerwony fioletem goryczki lub np. barwienie PASS - odczynnik Schaffa - jest przezroczysty, a barwienie powoduje powstawanie purpurowego zabarwienia w tkance.

9. Zamykanie preparatów

• trzeba znów pozbawić tkankę wody (szereg alkoholi - odwodnienie; prześwietlenie w ksylenie)

• zamykanie w medium poprzez jego naniesienie (balsam kanadyjski, żywice syntetyczne DPX)

• delikatne umieszczenie szkiełka nakrywkowego bez pęcherzyków powietrza

* przy stosowaniu balsamu kanadyjskiego należy pamiętać, że może on powodować lekkie odbarwienie niektórych barwników anilinowych, a także daje lekko żółte zabarwienie

* odchodzi się od balsamów bo przebarwiają tkanki (żółtawy kolor), częściej używa się teraz syntetycznych żywic

* DPX - nie powoduje bladnięcia wybranych preparatów

* Glicerol:

- dobrze miesza się z wodą

- nie wymaga zupełnego odwadniania i prześwietlania skrawków

- stosowany przy fluoroznacznikach

- nie jest trwały; wymagane jest obramowanie na szkiełku, aby nie wnikało powietrze

- stosowany głownie do zamykania preparatów, w których wykrywamy tłuszcze

Płyny konserwujące powinny:

• chronić preparaty przed wyschnięciem i pękaniem

• nadać preparatom odpowiednią przejrzystość

• nie odbarwiać preparatów

10. Przyczyny powstawania artefaktów

• zabrudzone lub zatłuszczone szkiełko

• niewłaściwe utrwalenie materiału

• wysychanie preparatu w czasie obróbki (powiększenie jąder, złe wybarwienie chromatyny, zatarcie granic międzykomórkowych)

• zabrudzone alkohole lub ich nieodpowiednie stężenie

• zbyt krótkie płukanie preparatu w wodzie

• zbyt krótkie odwadnianie preparatu w ostatnich fazach barwienia (pozostawienie wody w preparatach powoduje kwaśne odczyny)

• zanieczyszczone barwniki i przestarzałe barwniki (barwniki wielokrotnie używane należy przesączać)

11. Techniki barwienia skrawków mrożonych

• skrojony skrawek przykleić do szkiełka podstawowego

• osuszyć strumieniem ciepłego powietrza w celu przyklejenia preparatu do szkiełka

• czasem też utrwalamy w płynie Dibosqa-Brasil'a

• zastosowanie odpowiednich barwników, np. H&E (czas barwienia będzie krótszy, ponieważ materiał nie jest utrwalony)

• odwodnienie w szeregu alkoholi

• prześwietlenie w ksylenie

• przykrycie substancją konserwującą

• zamknięcie pod szkiełkiem nakrywkowym

Archiwizacja preparatów mikroskopowych 30 lat

***

Substancje szkodliwe:

40% formaldehyd

Ksylen

Aceton

Alkohol absolutny i alkohol 96% skażony

Pierwsza pomoc przy formaldehydzie:

• Przy kontakcie z oczami: przepłukać duża ilościa wody przy szeroko odchylonej powiecie, skontaktować się z okulistą

• Przy kontakcie ze skórą: zmyć dużą ilością wody, zdjąć zanieczyszczone ubranie

• Przy spożyciu: podać dużą ilość wody, zaaplikować węgiel leczniczy 5-10g. Natychmiast wezwać lekarza. Płukanie żołądka

• Przy wdychaniu: świeże powietrze, jeżeli konieczne zastosować sztuczne oddychanie

mikrotom

rotacyjny

saneczkowy

automatyczny

ręczny

automatyczny

ręczny

ostrze noża diamentowego

preparat

Ułożenie preparatu względem noża: nieprawidłowe i prawidłowe

(2-3min, temp. pokojowa)

mikroskop świetlny (CISH)