Ćwiczenie 5

REAKCJA ŁAŃCUCHOWA POLIMERAZY (Polymerase Chain Reaction - PCR).
Wstęp teoretyczny.

Jest to metoda umożliwiająca wybiórcze powielenie żądanego fragmentu DNA bez konieczności jego oddzielenia od innych sekwencji. Główną zasadą metody jest polimeryzacja DNA przy pomocy odpowiednio dobranych starterów (primerów) DNA, w taki sposób, że powieleniu ulega jedynie fragment DNA zlokalizowany pomiędzy parą („forward” i „reverse”) starterów. Taki wynik otrzymuje się w odpowiednio dobranym środowisku (ważne jest stężenie substratów oraz kationów jedno- i dwuwartościowych), istotnym warunkiem jest dobranie odpowiedniej temperatury i czasu trwania poszczególnych etapów reakcji PCR. Niezwykle istotne jest też dobranie starterów o właściwych parametrach.

Głównymi etapami reakcji są:

• denaturacja wyjściowych cząsteczek DNA

• wiązanie starterów (annealing)

• wydłużanie łańcucha DNA (extension)

Etapy te powtarzane są cyklicznie, co powoduje wykładniczy wzrost produktu reakcji (każdy produkt reakcji stanowi matrycę w kolejnym cyklu PCR). Po 25 cyklach powielania DNA
z jednej kopii można uzyskać 10⁶ cząsteczek wybranego fragmentu DNA.

Startery (primery)

Sekwencja nukleotydowa starterów jest komplementarna do początkowego fragmentu namnażanej nici DNA (forward) oraz zgodna z końcowym fragmentem namnażanej nici DNA (reverse). Startery powinny mieć długość 15-25 nukleotydów, ważne jest, żeby ich sekwencja nukleotydowa była unikalna, tzn. nie powtarzała się w badanym genomie. Startery powinny zawierać 40-60% nukleotydów G i C, i nie powinny zawierać odwróconych powtórzeń. Temperatura topnienia (T_m) podwójnoniciowej cząsteczki utworzonej przez oba startery
z matrycą powinna być podobna (różnica T_m <5⁰C), na końcu powinien być nukleotyd G lub C, ale nie więcej niż jeden. Startery nie powinny być komplementarne względem siebie
(max. 3 kolejne nukleotydy mogą być komplementarne), ani zawierać ciągów puryn
lub pirymidyn.

Wyznaczanie T_m dla starterów:

T_m = 2(N_A+N_T) + 4(N_G+N_C),

gdzie : N_A - ilość nukleotydów adeninowych,

N_T - ilość nukleotydów tymidynowych,

N_G - ilość nukleotydów guaninowych,

N_C - ilość nukleotydów cytozynowych,

Składniki mieszaniny reakcyjnej :

1. Matryca DNA, pojedynczo- lub podwójnoniciowa, najczęściej liniowa.

2. Startery (oligonukleotydy) o odpowiedniej sekwencji

3. Trójfosforany deoksynukleotydów (dNTPs) - mieszanina równych ilości (po 200-250 μM); dATP, dTTP, dCTP, dGTP.

4. Kationy II-wartościowe - Mg⁺². Ponieważ kationy te są wiązane przez DNA
   i nukleotydy (poprzez grupy fosforanowe), dla każdej reakcji dobiera się optymalne stężenie Mg⁺², zwykle 1.5 mM

5. 10 mM bufor, najczęściej Tris-HCl, pH 8.3 - 8.8, w temperaturze 72⁰C pH wynosi
   ok. 7,2.

6. Kationy I-wartościowe 50-100 mM KCl

7. Termostabilna polimeraza DNA, najczęściej używana jest polimeraza izolowana
   z Termophilus aquaticus (Archea) - polimeraza Taq.

Warunki reakcji PCR

1. Denaturacja: używa się maksymalnej temperatury, tolerowanej przez polimerazę. Dla polimerazy Taq wynosi ona 94-95⁰C. Jest to temperatura wystarczająca do całkowitej denaturacji matryc o zawartości G+C do 55%. Matryce bogate w pary GC wymagają polimeraz odpornych na wyższe temperatury, np. polimerazy izolowanej z Pyrococcus woesei (Pwo) lub Pyrococcus furiosus (Pfu). Średni czas denaturacji wynosi 30 sekund.
   

2. Przyłączanie starterów (annealing): używa się temperatury niższej o 3-5⁰C
   od skalkulowanej T_m dla starterów (jeśli startery mają różne temperatury T_m, wybiera się niższą z nich). Dokładną temperaturę przyłączania starterów wyznacza się doświadczalnie testując reakcję w granicach 2-10⁰C poniżej T_m. Standardowy czas przyłączania starterów to 30 sekund.

Zbyt wysoka temperatura przyłączania starterów powoduje silne obniżenie wydajności reakcji,
zbyt niska prowadzi do powstania niespecyficznych produktów reakcji (proszę się zastanowić, dlaczego?).

3. Wydłużanie łańcucha DNA (elongacja): Zachodzi w temperaturze optymalnej dla używanej polimerazy. W przypadku polimerazy Taq jest to 72-78⁰C. Wydajność polimeraz jest różna, w przypadku polimerazy Taq wynosi 2000 nt/min. Czas wydłużania łańcucha dla polimerazy wylicza się na podstawie długości powielanego fragmentu DNA przyjmując (dla polimerazy Taq) 1 minutę na każde 1000 nt.

Ilość cykli denaturacji/przyłączania starterów/elongacji wyznacza się tak, aby uzyskać jak największą ilość specyficznego produktu (a więc zanim wyczerpie się jeden z substratów). Ilość ta zależy min. od dokładności polimerazy. Dla polimerazy Taq stosuje się co najmniej 25, do 30 cykli.

Ćwiczenie 5

I. Składanie reakcji PCR dla genu mtTFA (mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A)

Odczynniki:

H₂O dejonizowana

Bufor do PCR II (Perkin Elmer) 10x

MgCl₂ 25 mM

dNTPs (mieszanina) 5 mM

starter F 25 pM/μl

starter R 25 pM/μl

polimeraza Taq 5U/μl

DNA komórkowe 50 ng/μl

Mieszanina reakcyjna zawiera w 50 μl objętości końcowej:

Bufor do PCR II (Perkin Elmer) 1x

MgCl₂ w stężeniu 1,5 mM

dNTPs (mieszanina) w stężeniu 200 μM

starter F 50 pM

starter R 50 pM

DNA komórkowe 100 ng

Polimeraza Taq 2 U

H₂O dejonizowana

Razem: 50 μl

Wykonanie:

Odczynniki bardzo dokładnie mieszać przez pipetowanie po każdym dodaniu kolejnych składników. Pamiętać o właściwym pipetowaniu prób (przy pobieraniu nie dociskać tłoczka do końca, a tylko do pierwszego oporu!). Wszystkie odczynniki należy od razu po pobraniu odkładać do naczynia z lodem. Po zakończeniu pipetowania próby zworteksować, zwirować
i odpipetować 25 µl do probówki o objętości 200 µl (lub do paska zawierającego zestaw takich probówek). Zapisać pozycję swojej sekcji. Pozostałe 25 µl (porządnie podpisane) zostawić we wspólnym pojemniku. Wstawić do termocyklera, wprowadzić warunki reakcji PCR:

1. Denaturacja 1 10 min.

2. cykl 1

1. Denaturacja 94⁰C, 30 sek.

2. Annealing 64⁰C, 30 sek.

3. Elongacja 72⁰C, 1 min.

3. 35 cykli

4. Elongacja końcowa 72⁰C, 10 min.

5. Koniec, 4⁰C

Produkty reakcji zostaną rozdzielone w żelu agarozowym 1.5%, a wyniki będą przesłane na adres grup.

II. Ćwiczenie teoretyczne

Obliczanie T_m dla podanych starterów, wybranie właściwej pary starterów do podanego genu (mtTFA)

Sekwencja eksonów szczurzego genu mtTFA

(mitochondrialny czynnik transkrypcyjny A)

GGCATGATAACAAGCCCCTGGAGTACCCACGCGGGTTTCGTGGCTGTGTGTAGGCACAGTGTCGCGTGGGACGAACCGGACGGCGCCGGGCCTATAGTCGTCGGCCCGAGGGATGGCGCTGTTCCGGGGAATGTGGGGCGTGCTAAGAACACTGGGGCGCACGGGGGTCGAGATGTGCGCGGGCTGCGGGGGCCGCATACCCTCGCCTGTCAG

CCTTATCTGTATTCCGAAGTGTTTTTCCAGCTTGGGTAATTATCCAAAGAAACCTATGAGTTCATACCTTCGATTTTCTACAGAACAGCTACCCAAATTTAAAGCTAAACACCCAGATGCAAAAGTTTCAGAACTGATTAGAAAAATTGCAGCCATGTGGAGGGAGCTTCCGGAAGCAGAAAAAAAGGTGTATGAAGCGGATTTTAAAGCTGAGTGGAAGGTGTACAAAGAAGCTGTGAGCAAGTATAAAGAGCAGCTAACTCCAAGTCAGCTGATGGGCTTAGAGAAGGAAGCCCGGCAGAAACGCCTAAAGAAGAAAGCACAAATCAAGAGGAGAGAATTAATTTTGCTTGGAAAACCAAAAAGACCTCGGTCAGCATATAACATTTACGTATCTGAAAGCTTCCAGGAGGCTAAGGATGAGTCAGCTCAGGGGAAATTGAAGCTTGTAAATCAGGCTTGGAAAAATCTGTCTCATGATGAAAAGCAGGCATATATTCAGCTTGCTAAAGATGATAGAATTCGTTATGACAATGAAATGAAGTCTTGGGAAGAGCAAATGGCTGAAGTTGGGCGAAGTGATCTCATCCGTCGCAGTGTGAAGCGACCCCCGGGAGACATCTCTGAGAATTAAGATTGAAGACAGAGTTGTCATTGGGATTGGGCACAA

GAAGCTGGTTAAGTCTCAAAGCCTTAAGTTGTCAAACTTGAAAGGATAAAGGGGTTAACCTTTGACACTCAGTTCATTTTTCTGTAGCCCATGGACTTCTGCCCACTGAATGCATTTCTGTTGACCTTTTGAGCCTTGACAGTAGATCATGACGAGTTCTGCCGTTTGCTTAAGAACTGGAATCAAGACTGTGCGTGCATCTGCATGCAGTGGTGAATTGTTCTGCATTTGATGGTGTAGACAGACTGAAGTGACTTTCACACTGGTGACAGTTTCGTGCGGGTTTGTGAAGTTCTTACACTGATGGCCATTACATGTGGGTGCCCCCTTGTCCCAGGCCCAGAGCTGCTCACAGCTGTGGCAGAGCCATTGCAGTTTCTAAGAACCTTCCGGGCTTTACTAGATGACGTGGTTTCTAGACATAATCATGTGTAGAGTTGATGTTTGTACACAATAAGTGATCATCGATGTCCTAACAGCATTTTATAGTAGGAGAGATTTACAAGTCTTTCTCAAATTAAGAAATTATGTACCAGGTCTATGCATATGTTTTTATTGCATAGAATAAAAACTCTAATTTTCCAAAC

Na żółto zaznaczone sekwencje odpowiadające starterom F lub R

Dostępne startery:

1

ATTACCCAAGCTGGAAAAACACTT

2

GAGTACCCACGCGGGTTTCG

3

TGTATTCCGAAGTGTTTTTCCAGCTT

4

TGTGCCCAATCCCAATGACA

---