Biofizyka, wykład 6
NMR - określanie konformacji w roztworze
krystalografia rentgenowska - określanie struktury w stanie krystalicznym; główna zaleta: metoda najlepsza dla białek, rozwiązano nią 80% struktur białkowych, daje się stosować dla dużych układów molekularnych, większych niż NMR
NMR - można stosować NMR w ciele stałym, ale aktualnie zwykle stosuje się NMR w roztworach wodnych, trudniej niż przy krystalografii rozwiązać złożone układy molekularne, dobre dla niekrystalizujących substancji
Woda nieustrukturalizowana stanowi często nawet 50% kryształu molekularnego białek. Są rozbieżności struktur krystalicznych uzyskanych w krysztale w rentgenografii i tych samych białek w roztworze techniką NMR. Na 70 białek około 18 wykazuje odstępstwa strukturalne między wyznaczonymi strukturami za pomocą tych dwu technik. (Proteins 60, 134, 2005)
Struktura kwadrupleksu DNA uzyskana została metodą krystalografii
granicą w krystalografii - cały rybosom bakteryjny wykrystalizowany (2,5 MDa)
granica w NMR - można uzyskiwać widma i je analizować nawet dla układów chaperoninów GroEL i GroES, około 1 MDa
Dużego znaczenia nabrały metody, które nie mają rozdzielczości atomowych, ale analizują całe układy, są to techniki mikroskopowe (struktura przestrzenna jest uzyskiwana od razu). Można zejść niżej dzięki odpowiednim przekształceniom komputerowym.
Granica rozdzielczości mikroskopów optycznych - 200 nm, bo w mikroskopie wykorzystuje się optykę geometryczną, która nie zakłada falowej natury światła. Dochodzi się do granicy 200 nm (czyli mniej niż długość światła widzialnego), dlatego że stosuje się triki techniczne.
SNOM - mikroskopia bliskiego pola - rozdzielczość do 50 nm
jedna z technik mikroskopii elektronowej - cryoEM
wykorzystuje się falową własność elektronów, których długość fali zależy odwrotnie proporcjonalnie od prędkości. Im szybciej się poruszają elektrony, tym mniejszą mają długość fali i granica dyfrakcyjna przejawia się dużo niżej. Długości fali rzędów angsztremów nawet, ale występują aberracje (soczewki magnetyczne) i trudności techniczne sprawiają, że rozdzielczość sięga tylko 1 nm (10 A). Jest to 2-3 rzędy gorzej niż NMR czy krystalografia. CryoEM daje obrazy molekuł i kompleksów molekularnych.
Inna technika - AMF (mikroskopia sił atomowych) - schodzi do dziesiątych części nanometra. Działa na zupełnie innej zasadzie niż mikroskopia optyczna czy elektronowa. Nie chodzi o falową naturę cząstek. W AMF badaną cząsteczkę czy kompleks umieszczamy na odpowiednim podłożu (często mika), a potem skanujemy ostro zakończonym rylcem (musi mieć jak najmniejsze ostrze). Rylec jest utrzymywany w stałej odległości od skanowanej powierzchni, bo między rylcem a powierzchnią występują siły van der Waalsa - siły rzędu pN (pikonjutonów, 10-12 N) Utrzymanie stałej odległości umożliwia układ kompensacyjny, laser rejestruje jak porusza się rylec, który zakreśla powierzchnię badanej cząsteczki.
Promień krzywizny najlepszych rylców - 10-20 nm
Można uzyskać obraz nawet poniżej 1 nm rozdzielczości
Dzięki AFM możemy uzyskiwać struktury w naturalnym środowisku (w kropli buforu naturalnego). Można uzyskiwać informacje o niezbyt szybkich procesach zachodzących w układzie.
AFM może zostać wykorzystany jako przyrząd do manipulowania pojedynczymi cząsteczkami (inne narzędzia do takich celów - szczypce optyczne i magnetyczne)
Badanie dynamiki ruchów molekularnych
τ - średni czas zachodzenia ruchu molekularnego
Ruchy:
przypadkowe ruchy translacyjne i rotacyjne
przypadkowe ruchy wewnętrzne
Różne domeny białka τ = 10-7 - 10-8 s
Drgania atomów cząsteczki τ = 10-12 - 10-14 s
k = 1/ τ - szybkość przejścia z jednego położenia w drugie położenie
Amplituda takiego ruchu - wychylenia w jednostkach odległości lub kątowe, ruchy są periodyczne
Chcemy wyjść poza obraz sztywnej struktury, badamy ruchy molekularne.
Rentgenografia w wersji Lowego - klatka po klatce można uzyskiwać obrazy dyfrakcyjne i badać zachodzenie procesów enzymatycznych
MD (molecular dynamics) - symuluje komputerowo dynamikę molekularną, MD w skali nanosekund
Przybliżone pole siłowe (przybliżenie klasyczne wystarczające dla makrocząsteczek, nie przejawiają się silnie efekty kwantowe) .
Metodami numerycznymi rozwiązujemy równanie Newtona i uzyskujemy połozenie i prędkości atomów w różnych cząsteczkach. Jak zmieniają się położeenia atomów w czasie - 10-15s muszą być krótsze niż drgania molekularne.
Oprócz samego biopolimeru ważne są również atomy wody otaczające (nie możemy naszej cząsteczki rozpatrywać w próżni). Każdy krok obliczeń wykorzystuje bardzo duże moce obliczeniowe.
300 aa białko w rozpuszczalniku wodnym - możemy ciągnąć taką symulacje nie dłużej niż 10-8 s - po drodze łapią się procesy krótsze niż 10-8 s.
Zwijanie białek - 10-5 - 10-2 s - za pomocą MD nie przybliżymy się do tych procesów
Jeśli jako pojedyncze punkty zastosujemy całe grupy atomów to zmniejszymy ilość zmiennych i symulacja będzie mogła być dłuższa.
Układ dąży do stanu minimalnej energii - jak będziemy długo prowadzić obserwację to układ wpadnie do takiej konformacji (ale trwa to za długo). Możemy na przykład wyznaczyć najpierw w NMR odległości atomowe i podać jako dane do komputera (rMD). Nie jest to czysta dynamika molekularna, dodajemy coś, co uzyskaliśmy w innych doświadczeniach.
Kwasy nukleinowe
DNA jest zbudowany z 4 nukleotydów - pirymidynowych dCMP i dTMP i purynowych dAMP i dGMP. DNA powstaje w wyniku replikacji.
Zasada komplementarności.
Nić pierwotna - nić potomna połączone po replikacji semikonserwatywnej.
Struktura pierwszorzędowa - kolejność nk od 5' do 3'-końca, uwarunkowana procesem replikacji i komplementarnością zasad
Cukry w nukleotydach (deoksyryboza, ryboza) - pierścień furanu
ważne atomy węgla C1' i C4' - obydwa te węgle są podstawione czterema różnymi podstawnikami, te cząsteczki mogą występować w różnych izomerach optycznych (enancjomerach)
Struktura β - C1' - tlen do tyłu, zasada do góry, wodór do dołu
α-nukleotydy nie występują w DNA
struktura D - na atomie C4'
β-D-2'-deoksyrybofuranoza
Rola DNA: nośnik informacji genetycznej - w strukturze pierwszorzędowej zapisane jest całe funkcjonowanie komórki
Kwas DNA jest bardzo podobny do RNA, ale cząsteczki te różnią się znacznie trwałością i rolą
Ważna jest grupa fosforanowa. W pH fizjologicznym grupa fosforanowa jest całkowicie zjonizowana. W roztworze przy ładunkach tej grupy znajdują się przeciwjony (sodowe, potasowe, kationy dwudodatnie).
Niektóre wirusy potrafią syntetyzować DNA na matrycy RNA (odwrotna transkrypcja)
RNA
wiele typów (różnią się wielkością cząsteczek i funkcjonowaniem)
cukrem jest ruboza
UMP a nie dTMP jak w DNA
kwas RNA tworzy struktury oligonukleotydowe
duża ilość modyfikowanych nukleotydów
10^6 - chloroplastowy DNA, 10^4 mitochondrialny DNA, 10^8 chromosomowy DNA; kwasy rybonukleinowe krótsze, zwykle nie przechowują informacji
u RNA-wirusów RNA może być nośnikiem informacji (10^3 - 10^4 nk, może być dwuniciowe)
mRNA (<10^4 nk) - do 5000 nk
rRNA
snRNA (małe jądrowe RNA w spiceosomach)
tRNA (75-90 nk)
miRNA (około 20 nk)
Budowa chemiczna zasad
zasady są płaskie
mogą w niskich pH ulegać protonacji (przy N1 i N7 w A, przy N3 w C, przy N7 w G)
w wysokich pH moą od nich oddysocjowywać protony (przy N3 w U, przy N1 w G)
pH = 7 - nie zdeprotonowane, ani sprotonowane
cząsteczki mają azoty i tleny; wodory nie muszą być stale przyłączone do tych atomów, mogą zmieniać swoje położenie, jeśli nie przyłączają się do węgli; reorganizują się wtedy wiązania podwójne w cząsteczce i powstają różne formy tautomeryczne tej samej cząsteczki
tautomery dominumace - zostały określone przy badaniu widm, za pomocą rentgenografii
jeżeli zmieniamy formę tautomeryczną mogą się zmieniać zasady parowania i dochodzić do niekomplementarnego parowania
na pewnym etapie może zajśc do takiego błędnego parowania i powstaje mutacja punktowa, jeżeli nie zostanie to naprawione w procesach replikacyjnych; mutacje punktowe mogą wiec być związane z powstawaniem różnych forma tautomerycznych zasad azotowych
Wyszukiwarka