Temat 3: Morfologia grzybów drożdżowych i pleśni
Literatura:
Kocwowa E.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej dla wyższych szkół technicznych. PWN 1984, str. 122 - 129,
Grabińska - Łoniewska A.: Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii ogólnej. Politechnika Warszawska 1996, str. 162 - 167.
Schlegel H.: Mikrobiologia ogólna. PWN 1996, rozdz. 5 Grzyby (Mycota)
Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:
Umieć scharakteryzować drożdże właściwe, grzyby drożdżoidalne i pleśnie, z uwzględnieniem ich znaczenia dla człowieka i podaniem przykładowych gatunków; znać morfologię drożdży i pleśni; znać rodzaje zarodników grzybowych; rozumieć pojęcia: pączkowanie, grzybnia, pseudogrzybnia, grzybnia wegetatywna, zarodniki wewnętrzne i zewnętrzne; umieć wykonać preparat przyżyciowy i barwiony grzybów oraz sprawnie nastawić obraz pod mikroskopem; umieć rozróżniać pod mikroskopem drożdże od bakterii oraz podstawowe rodzaje pleśni (pleśniak, rozłożek, pędzlak, kropidlak); umieć opisać morfologię kolonii grzybowych; umieć zmierzyć wymiary komórek
Grzyby, w przeciwieństwie do bakterii, są organizmami eukariotycznymi. Kiedyś były one uważane za rośliny i jeszcze do dziś są omawiane w podręcznikach botaniki. Jednak grzyby tworzą zupełnie odrębne królestwo organizmów, nie spokrewnione z roślinami ani zwierzętami. Przedmiotem zainteresowania mikrobiologii są jedynie tzw. grzyby mikroskopowe obejmujące drożdże i pleśnie.
Drożdże są grzybami jednokomórkowymi i występują dziko w miejscach o dużym nagromadzeniu węglowodanów: w sokach wydzielanych przez rośliny (np. po zranieniu lub jako nektar w kwiatach), na owocach, a także w glebie czy na odchodach zwierzęcych. Niektóre powodują choroby u człowieka, zwane drożdżycami (ogólnie mikozami), a wywołane np. przez Candida sp. - kandydozami. Candida albicans wywołuje tzw. pleśniawki, zmiany w błonie śluzowej jamy ustnej w postaci charakterystycznych białych plamek. Drożdże w szerokim znaczeniu obejmują zarówno drożdże właściwe, jak i grzyby drożdżopodobne. Drożdże właściwe należą do workowców, ponieważ wytwarzają zarodnie workowe (worki), a w nich zarodniki workowe (askospory) w procesie rozmnażania płciowego. Należą tu powszechnie znane drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae. Natomiast grzyby drożdżopodobne (drożdżoidalne, drożdże bezworkowe) nie rozmnażają się płciowo, a więc nie wytwarzają worków i są zaliczane do prowizorycznego taksonu tzw. grzybów niedoskonałych, grupujących grzyby, które zatraciły zdolność do wytwarzania ogranów rozmnażania płciowego. Należą tu np. gatunki z rodzaju Candida i Rhodotorula.
Drożdże, zarówno workowe, jak i bezworkowe, cechuje charakterystyczny sposób rozmnażania bezpłciowego w postaci tzw. pączkowania. Polega ono na tym, że w pewnym miejscu komórka tworzy rosnące stopniowo uwypuklenie, do którego przechodzi jedno z powstałych po podziale jąder potomnych. Następnie wytwarza się ściana komórkowa oddzielająca komórkę potomną od macierzystej. U drożdży piekarniczych powstałe komórki są jednakowej wielkości i oddzielają się od siebie. Po oddzieleniu, na obu komórkach (potomnej i macierzystej) pozostaje trwała blizna. W miejscu starej blizny komórka nie może utworzyć nowego pączka, a więc liczba blizn świadczy zarówno o wieku komórki, jak i o jej zdolności do rozmnażania. U grzybów drożdżoidalnych komórki często nie rozdzielają się po pączkowaniu i wydłużają tworząc tzw. pseudogrzybnię w postaci rozgałęziających się łańcuszków, gron lub krzaczków. Pseudogrzybnia (pseudomycelium) to wydłużone, nitkowate struktury, często rozgałęziające się, utworzone wyłącznie przez komórki pączkujące. Struktura ta przypomina prawdziwą grzybnię (mycelium). Ta jednak utworzona jest przez komórki dzielące się, a nie pączkujące i jest charakterystyczna dla grzybów pleśniowych.
Chociaż zdolność do pączkowania jest cechą charakterystyczną większości drożdży, to nie jest to cecha wyłącznie tej grupy grzybów (zdolność do pączkowania mają też np. niektóre podstawczaki). Niektóre drożdże nie pączkują, lecz rozmnażają się bezpłciowo przez zwykły podział komórki. Są to tzw. drożdże rozszczepkowe.
Drożdże mogą również rozmnażać się przez zarodniki, czyli spory. Oprócz wspomnianych zarodników workowych, czyli askospor (wytwarzanych tylko przez drożdże właściwe w procesie płciowym), drożdże wytwarzają też zarodniki na drodze bezpłciowej. Mogą to być blastospory, które powstają w wyniku pączkowania (charakterystyczne np. dla Candida sp.) lub chlamydospory, czyli zarodniki przetrwalnikowe, charakteryzujące się grubą ścianą.
Drugą grupą grzybów mikroskopowych są pleśnie. Jest to popularna nazwa określająca grzyby tworzące grzybnię zbudowaną z luźno skupionych strzępek, tzw. grzybnię powietrzną. Grzybnia ta tworzy charakterystyczne watowate skupienia o różnorodnym zabarwieniu (zielonym, zielononiebieskim, żółtym, różowym, białym lub czarnym). Wytwarza ona zarodniki i wyrasta z tzw. grzybni wegetatywnej, wrośniętej w podłoże, z którego pobiera substancje odżywcze. Podobnie jak drożdże, pleśnie również nie stanowią grupy jednorodnej systematycznie. Należą tu bowiem zarówno przedstawiciele grzybów niższych - sprzężniaki z rzędu pleśniakowców (pleśniak i rozłożek), jak i grzyby wyższe - workowce właściwe (kropidlak, pędzlak). Pleśnie rozmnażają się za pomocą zarodników.
Sprzężniaki z rzędu pleśniakowców, jak pleśniak biały (Mucor mucedo), czy rozłożek czerniejący (Rhizopus nigricans) wytwarzają grzybnię nie podzieloną ścianami poprzecznymi (septami) na poszczególne komórki. Są więc komórczakami - tworzą jedną dużą wielojądrową komórkę. Wytwarzają one (bezpłciowo i na drodze płciowej) zarodniki wewnątrz kulistych zarodni (sporangiów) osadzonych na trzonkach zarodnionośnych (sporangioforach). Pleśnie te wytwarzają więc zarodniki wewnętrzne.
Pleśnie należące do workowców, a więc kropidlaki (Aspergillus spp.) i pędzlaki (Penicillium spp.) tworzą grzybnie wielokomórkowe, a więc podzielone ścianami poprzecznymi i wytwarzają tzw. zarodniki konidialne (konidiospory), czyli konidia. Konidia to zarodniki tworzone zewnętrznie, tj. przez odcięcie końcowej (górnej) części specjalnej, pionowo wzniesionej strzępki, zwanej strzępką konidionośną albo konidioforem.
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
Zadanie 1. Barwienia komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae za pomocą fioletu
krystalicznego
Przygotowanie i utrwalenie preparatu:
Odtłuścić na sucho szkiełko przedmiotowe pocierając je dość mocno kawałkiem mydła (z jednej strony), po czym usunąć jego resztki czystą szmatką
Zapalić palnik gazowy i wyżarzyć w płomieniu ezę
Po ostudzeniu ezy opalić korek i wylot probówki zawierającej zawiesinę drożdży przeznaczoną do barwienia
Małym palcem tej ręki, która trzyma ezę wyciągnąć korek z probówki i (trzymając go) pobrać ezą oczko zawiesiny
Opalić wylot probówki i korek, a następnie zamknąć nim probówkę
Odstawić probówkę do statywu
Wykonać rozmaz pobranej zawiesiny po odtłuszczonej powierzchni szkiełka
Odłożyć preparat na ramki wanienki w celu wysuszenia.
Wyżarzyć ezę i odstawić ją do statywu
Po wyschnięciu preparatu chwycić go pęsetą i trzykrotnie przesunąć nad płomieniem palnika (utrwalanie termiczne).
Barwienie fioletem krystalicznym:
Odczekać chwilę i zalać utrwalony preparat fioletem krystalicznym na 1,5 minuty
Spłukać wodą i wysuszyć przykładając delikatnie kawałki bibuły
Umieścić preparat na stoliku mikroskopowym i nastawić obiektyw 10x
Śrubą mikrometryczną nastawić ostrość
Zmienić obiektyw na 40x i obserwować preparat
Wykonaj rysunek zaznaczając komórki pączkujące:
Zadanie 2. Obserwacja zarodników workowych (askospor) drożdży Saccharomyces
cerevisiae w preparacie przyżyciowym
1. Umieścić kroplę wody na szkiełku podstawowym
2. Pobrać ezą niewielką ilość hodowli drożdży z pożywki sporulacyjnej i zawiesić w
kropli wody
3. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować pod mikroskopem stosując
początkowo obiektyw 10x, a następnie 40x.
Wykonać rysunek zaznaczając worki i zarodniki workowe (askospory)
Zadanie 3. Obserwacja komórek grzybów drożdżoidalnych w preparacie przyżyciowym
1. Umieścić kroplę wody na szkiełku podstawowym
2. Pobrać ezą niewielką ilość hodowli grzybów drożdżoidalnych i zawiesić w
kropli wody
3. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować pod mikroskopem stosując
początkowo obiektyw 10x, a następnie 40x.
Wykonać rysunek zaznaczając komórki pączkujące
Zadanie 4. Obserwacja grzybów pleśniowych w preparacie przyżyciowym
1. Umieścić kroplę wody na szkiełku podstawowym
2. Pobrać ezą niewielką ilość hodowli grzybów pleśniowych i zawiesić w
kropli wody
3. Przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować pod mikroskopem stosując
początkowo obiektyw 10x, a następnie 40x.
Wykonać rysunek zaznaczając: strzępki wegetatywne, strzępki zarodnionośne, zarodnie z zarodnikami lub zarodniki konidialne i inne wyróżniające się struktury
Zadanie 5. Pomiar wielkości komórek grzybowych (drożdży i pleśni) za pomocą okularu
mikrometrycznego
1.Wycechować mikrometr okularowy przy nastawionym obiektywie 40x, tzn. określić
wartość odległości między kreskami podziałki, za pomocą płytki z podziałką
wzorcową (jedna działka na płytce wzorcowej równa jest 0,01 mm) i obliczyć
powiększenie obiektywu (P).
2. Dokonać pomiaru długości i szerokości komórki grzybowej (ΔL = L2 - L1) nastawiając
wskaźnik (środek krzyża) na punkty krańcowe komórki.
3. Obliczyć rzeczywiste wymiary badanej komórki X = ΔL/P
Porównaj wymiary komórek grzybowych z wymiarami komórek bakterii
Zadanie 6: Opis morfologii kolonii grzybowych
Opisz morfologię kolonii grzybowych wyrosłych na pożywce Sabouraud'a na szalce Petriego uwzględniając: wielkość, kształt, wzniesienie, brzeg, przejrzystość, barwę, strukturę.
Opisując kolonie korzystaj z lupy i tablic.
Porównaj kolonie drożdży z koloniami pleśni. Wykonaj rysunki
.