10.06.2013 r.

Karolina Antosiak,
Aleksandra Bachanek,
Maria Kłeczek,
Agnieszka Lechniak,
Martyna Sekuła

Sprawozdanie

Ćwiczenia laboratoryjne z mikrobiologii

Temat : Grupy fizjologiczne mikroorganizmów biorących udział w procesie kompostowania odpadów komunalnych.

Cel : Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie badań biologicznych dla określenia stopnia rozkładu odpadków oraz unieszkodliwienia kompostu pod względem sanitarnym.

Zakres ćwiczenia:

1. Określenie stopnia rozkładu odpadów na podstawie stosunków ilościowych pomiędzy mikroorganizmami, biorącymi udział w różnych etapach procesu kompostowania, przeprowadzając badania mikrobiologiczne:

• ilościowe

• bakterii mezofilnych, termofilnych, sporowych, promieniowców i pleśni

• grup fizjologicznych

• bakterii amonifikacyjnych, nitryfikacyjnych I i II fazy i denitryfikacyjnych

2. Określenie stopnia unieszkodliwienia kompostów pod względem sanitarnym na podstawie wskaźników:

• bakteriologicznych

• bakterii Proteus vulgaris, grupy coli, grupy coli typu kałowego i Clostridium perfringens

Materiały do badań :

• próbki do badań : kompost surowy

Wstęp teoretyczny:

Jedną z najczęściej stosowanych metod unieszkodliwiania odpadków miejskich jest kompostowanie. W procesie tym odpadki pochodzenia organicznego poddawane są tlenowemu przerobowi w pryzmach lub dołach na wolny powietrzu. W celu skrócenia czasu trwania tego procesu stosowane są tzw. Biostabilizatory, w których zachodzi nawilżenie, mieszanie, napowietrzanie rozdrobnionej masy oraz jej wstępny rozkład. Po okresie biostabilizacji materiał kompostowy ulega dalszej przeróbce w pryzmach.

Ogólnie proces kompostowania można określić jako intensywny cykl przemian biochemicznych prowadzących do częściowej mineralizacji i humifikacji związków organicznych występujących w odpadkach miejskich. W wyniku procesu humifikacji powstaje próchnica czyli humus. Próchnica wprowadzana do gleb uprawnych polepsza ich strukturę, a ulegając powolnej mineralizacji stanowi źródło substancji pokarmowych dla roślin.

Intensywność przemian biochemicznych w procesie kompostowania zależy od rodzaju substancji organicznych poddawanych rozkładowi, od stopnia natlenienia, wilgotności, temperatury, odczynu masy kompostowej, a także od ilości i składu gatunkowego organizmów.

Wykonanie ćwiczenia:

Oznaczanie ogólnej liczby bakterii mezofilnych i termofilnych

• oznaczyć metodą płytkową Kocha, ogólną liczbę bakterii na agarze odżywczym;

• podłoża zaszczepić zawiesiną bakterii z rozcieńczeń 10^-4 - 10^-6cm³, stosując posiew głębinowy;

• inkubację bakterii mezofilnych prowadzić w temperaturze 26˚C
  w ciągu 48h, a bakterii termofilnych w 55˚C w ciągu 24h;

• po okresie inkubacji policzyć ilość wyrosłych kolonii.

Oznaczanie ogólnej liczby bakterii sporowych

• do badania użyć przygotowane rozcieńczenia próbek w zakresie
  10^-4 - 10^-6cm³. w celu usunięcia niesporowej flory bakteryjnej, zawiesiny ogrzewać w łaźni wodnej, w temperaturze 80˚C przez okres 15minut;

• po okresie inkubacji policzyć ilość wyrosłych kolonii.

Oznaczanie ogólnej liczby promieniowców

• oznaczyć metodą płytkową Kocha, ogólną liczbę promieniowców na podłożu wybiórczym wg Pochona;

• podłoża zaszczepić zawiesiną bakterii z rozcieńczeń 10^-1 - 10^-4cm³, stosując posiew głębinowy;

• po 7 dniach okresu inkubacji w temperaturze 26˚C policzyć ilość wyrosłych kolonii promieniowców.

Oznaczanie ogólnej liczby grzybów

• oznaczyć metodą płytkową Kocha, ogólną liczbę pleśni na podłożu wybiórczym wg Sabourauda, stosując posiew powierzchniowy próbek rozcieńczonych w zakresie 10^-1 - 10^-4cm³;

• po 3 i 5 dniach okresu inkubacji w temperaturze 26˚C policzyć ilość wyrosłych kolonii pleśni.

Oznaczanie miana bakterii amonifikacyjnych

• do badania użyć przygotowane rozcieńczenia próbek w zakresie
  10^-1 - 10^-6cm³. Wykonać posiew na podłoże płynne wg Skermana;

• hodowlę inkubować w temperaturze 26˚C przez 7dni,

• po okresie inkubacji wykonać obserwacje wzrostu bakterii: zmętnienia, obecności kożucha, osadu oraz oznaczania obecności amoniaku odczynnikiem Nesslera i odczynu podłoża;

• wynik oznaczenia podać jako miano, przyjmując za próby dodatnie hodowle, w których stwierdzono jednocześnie wzrost bakterii, obecność amoniaku oraz alkalizację podłoża do pH ok. 8,0 - 9,0.

Oznaczanie miana bakterii nitryfikacyjnych I i II fazy

• do badania użyć przygotowane rozcieńczenia próbek w zakresie
  10^-1 - 10^-5cm³. Wykonać posiew na podłoże płynne wg Winogradskiego;

• hodowlę inkubować w temperaturze 26˚C przez 7dni,

• po okresie inkubacji zbadać obecność azotynów - odczynnikiem Griessa, azotanów - odczynnikiem z brucyną;

• wynik oznaczenia podać jako miano, przyjmując za próby dodatnie hodowle, w których stwierdzono obecność bakterii oraz azotynów lub azotanów.

Oznaczanie miana bakterii denitryfikacyjnych

• do badania użyć przygotowane rozcieńczenia próbek w zakresie
  10^-1 - 10^-7cm³. Wykonać posiew na podłoże płynne wg Giltay'a;

• hodowlę inkubować w temperaturze 26˚C przez 7dni;

• po okresie inkubacji wykonać obserwacje wzrostu bakterii (zmętnienie, obecność kożucha), zmian w podłożu ( obecność gazu w rurce Durhana)

• wynik oznaczenia podać jako miano, przyjmując za próby dodatnie hodowle, w których stwierdzono jednocześnie wzrost bakterii
  i obecność gazu w rurce Durhana.

Oznaczanie miana bakterii gnilnych - Proteus vulgaris

• do badania użyć przygotowane rozcieńczenia próbek w zakresie
  10^-1 - 10^-6cm³. Wykonać posiew na agarze skośnym, wprowadzając po 1cm³ zawiesiny do wody kondensacyjnej;

• hodowlę inkubować w temperaturze 37˚C przez 24 - 48h;

• po okresie inkubacji określic miano bakterii Proteus vulgaris, przyjmując za próbki dodatnie hodowle, w których zaobserwowano pełzający wzrost bakterii na całej powierzchni skosu.

Oznaczanie miana bakterii grupy coli

• do badania użyć przygotowane rozcieńczenia próbek w zakresie
  10^-1 - 10^-7cm³;

• wykonać posiew na podłoże płynne wg Kasslera-Swenartona;

• hodowlę inkubować w temperaturze 37˚C przez 24 - 48h;

• po inkubacji dodatnie hodowle przesiać na podłoże laktozowe z TTC i tergitolem metodą powierzchniową;

• Inkubować w temperaturze 37˚C przez44h;

• Za wyniki dodatnie przyjmuje się charakterystyczne kolonie powodujące żółte zabarwienie podłoża;

Oznaczanie miana bakterii grupy coli typu kałowego

• Przesiać dodatnie próbki z badania bakterii grupy coli na podłożę laktozowe z zielenią brylantową oraz na podłoże peptonowe z tryptofanem;

• Hodowle inkubować w temperaturze 44˚C prze 24h;

• Wykonać obserwacje wzrostu bakterii w podłożu z zielenią brylantową (zmętnienie, oraz obecność gazu w rurkach Durhama)

• Zbadać obecność indolu w podłożu peptonowym z tryptofanem dodając do podłoża 0,5 cm³ odczynnika Ehrlicha-Böhme'a. Pod wpływem obecności indolu na granicy faz odczynnik-podłoże powstaje różowo-czerwone zabarwienie;

• Za wynik dodatni przyjmuje się te próbki w których zaobserwowano zarówno wzrost bakterii na podłożu laktozowym z zielenią brylantową jak i obecność indolu w podłożu peptonowym z tryptofanem. Wynik podajemy miano bakterii grupy coli typu kałowego;

Oznaczanie miana Closridium perfringers

• Do badania pobrać rozcieńczenia 10^-1 - 10^-6 i wprowadzić do pustych sterylnych probówek z korkiem;

• Probówki wstawić do łaźni wodnej i ogrzewać w temperaturze 80˚C przez 15 minut;

• Wlać do probówek rozpuszczone podłoże Wilsona-Blaira do około 2/3 objętości i dokładnie wymieszać;

• Hodowle inkubować w temperaturze 37˚C przez 24h;

• Wyniki oznaczenia podajemy jako miano bakterii Clostridium perfringens, przyjmując za próbki dodatnie hodowle, w których zaobserwowano zaczerwienienie podłoża świadczące o powstaniu siarczku żelaza;

Wyniki:

KOMPOST PO BIOSTABILIZATORZE

Bakterie	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6	10^-7	WYNIK
mezofilne				NP	NP	223		2,2*10^8jtk/g
temofilne				44	Próbka rozlana	2		1,2*10^6 jtk/g
sporowe				NP	78	48		2,8*10^7 jtk/g
promieniowce	0	0	0*	0*				niewiarygodny
grzyby	NP	NP	NP	259				2,6*10^7 jtk/g
amonifikacyjne	+	+	+	+	+	+		≤10^-6
nitryfikacyjne I fazy	+	+	+	+	+			≤10^-5
nitryfikacyjne II fazy	-	-	-	-	-			>10^-1
denitryfikacyjne	+	+	+	+	+	+		≤10^-6
Proteus vulgaris	+	+	+	+	+	+		≤10^-6
b. grupy coli	+	+	+	+	+	+	+	≤10^-7
grupy coli typu kałowego	-	-	-	-	-	-	+	≤10^-7
Clostridium perfringers	+	-	-	-	-	-		≤10^-1

KOMPOST PO DOJRZAŁY

Bakterie	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4	10^-5	10^-6	10^-7	WYNIK
mezofilne				114*	NP	Zły posiew		1,2*10^6jtk/g
temofilne				56	0*	0*		5,6*10^5 jtk/g
sporowe				NP	0*	5		5*10^6 jtk/g
promieniowce	NP	NP	48	11				7,9*10^5 jtk/g
grzyby	NP	?	27	4				3,4*10^5 jtk/g
amonifikacyjne	+	+	+	+	-	-		10^-^4
nitryfikacyjne I fazy	+	+	+	+	+			≤10^-5
nitryfikacyjne II fazy	+	+	+	+	+			≤10^-5
denitryfikacyjne	+	+	+	+	+	+		≤10^-^6
Proteus vulgaris	+	+	+	+	+	+		≤10^-^6
b. grupy coli	+	+	-	-	-	-	-	10^-^2
grupy coli typu kałowego	+	+	-	-	-	-	-	10^-^2
Clostridium perfringers	-	-	-	-	-	-		>10^-1

Wnioski:

---