ISTOTA PODZIAŁU: W procesie rozdziału mieszanin wykorzystuje się różne właściwości fizyczne,chemiczne i fizykochemiczne rozdzielanych składników.Chromatografia jest metodą rozdziału mieszanin w której rozdzielane składniki ulegają podziałowi pomiędzy 2 fazy z których jedna jest fazą ruchomą a druga nieruchomą.

WIELKOŚCI RETENCYJNE
Piki-składnik mieszaniny przedstawiony w postaci krzywej Gaussa.Piki odpowiadające składnikom dlużej przebywającym w kolumnie są szersze niż te odpowiadające przebywającym w kolumnie krócej. Składniki całkowicie od siebie oddzielone występują w postaci pików singletowych-te niecałkowicie rozdzielone występują jako dublety.Położenie pików na chromatogramie to podstawa analizy jakościowej,zaś ilościowej to pole powierzchni pod pikiem.
Indeks retencji dowolnej chromatografowanej sub X wyznacza się w stosunku do retencji n-alkanów, jednego o z at.C w cząsteczce eluowanego z kolumny przed sub X i drugiego o z+1 at C w cząsteczce eluowanego z kolumny po substancji X. Indeks retencji n-alkanu uzyskuje się mnożąc l.at.C w cząsteczce przez 100 (dla n-pentanu=500).Index retencji dla sub X obliczamy wg wzoru:

Półki teoretyczne- objętość kolumny w której zostaje osiągnięty stan równowagi pomiędzy stężeniami sub chromatografowanej w fazie ruchomej i nieruchomej.Kolumna składa się z N hipotetycznych półek teoretycznych, czyli: L=NH, gdzie H (WRPT-wysokość równoważna pólce teoretycznej-mówi o sprawności kolumny.
Równanie van Deemtera-przedstawia zależność wysokości półki teoretycznej(H) od średniej,liniowej prędkości przepływu fazy ruchomej przez kolumnę u. Ma ono postać:
H=A+B/u+Csu+Cmu+Cms
A-zalezy od wypełnienia kolumny(im mniejsze ziarna tym mniejsze A).
B-określa dyfuzję podłużną w fazie ruchomej
Cs-opór przenoszenia masy związany z fazą stacjonarną
Cm-związany z nierównomierną szybkością przesuwania się sub w kolumnie
Csm-wpływa na wysokość półki teor-część fazy zatrzymuje się w kanalikach wypełnienia.

Pompy stosowane w HPLC:

pompy stałociśnieniowe- gaz sprzężony pod stałym ciśnieniem oddziałuje na eluent ; wymusza stały przepływ. Zaletą tych pomp jest prosta konstrukcja i brak pulsacji ciśnienia, a wadą możliwość niepożądanych zmian przepływu fazy ruchomej spowodowanych zmianą lepkości cieczy wywołanej zmianą temperatury oraz zmiana oporu wypełnienia kolumny.

Pompy stałoprzepływowe- stały przepływ fazy ruchomej;

wyróżniamy pompy:
-z tłokiem posuwisto-zwrotnym (najczęściej z jednym lub dwoma tłokami); wadą ich może być pulsacja cieczy powodująca niestałość linii zerowej (pulsację można zmniejszyć przez zmniejszenie objętości cieczy pompowanej w jednym cyklu tłoka przez zastosowanie cylindrów o małej objętości i zwiększenie prędkości ruchów tłoka lub przez zastosowanie pomp dwutłokowych współdziałających w cyklu przesuniętym o 180^o)

-pompy strzykawkowe- pracują bezpulsacyjnie, a ich wadą jest stosunkowo mała ilość fazy ruchomej zużywanej w jednym cyklu pracy (może wynosić 250-500cm³), stąd konieczność przerywania procesu w celu napełnienia cylindra rozpuszczalnikiem
Dozowanie w HPLC.

Dozować w HPLC nie można ręcznie ze wzgl na b. Wysokie ciśnienia występujące w układzie. Stosuje się zawory dozujące z kapilarami (kilka- kilkadziesiąt μl); kierunek przepływu fazy ruchomej zależy od położenia zaworu, może omijać zawór lub przechodzić przez niego. Istnieją dwa typy pętli: zewnętrzna (wymienialna o zmiennej objętości od 0,01 do 0,5 cm³) i wewnętrzna o stałej małej objętości próbek rzędu kilku tysięcznych cm³.Zawory z pętlą umożliwiają wprowadzenie próbek w szerokim zakresie objętości i z dobrą odtwarzalnością.

Kolumny (zachodzi w nich właściwy proces rozdziału). W zależności od wielkości próbki możemy wybrać dla HPLC mikrokolumny, kolumny analityczne i kolumny preparatywne. Do celów analitycznych stosujemy zwykle kolumny analityczne. Są one zdecydowanie krótsze, dł. Ok. 15-20 cm, o średnicy kilku mm (ok. 3-5); wielkość porów wypełnienia 3-7 μm; kolumny są drogie, samodzielnie się ich nie przygotowuje, szybko się zużywają, dlatego stosuje się : prekolumny ( kolumny ochronne)- które montuje się przed kolumną właściwą, jej długość ok. 1-3cm. Działa jak filtr na zanieczyszczenia; przedłuża czas życia kolumny właściwej.

Detektory- powinny charakteryzować się dobrą czułością i wykrywalnością,szerokim zakresem liniowości wskazań,stabilnością wskazań,selektywnością lub uniwersalnością,łatwością obsługi i niskim kosztem utrzymania.

SPEKTROFOTOMETR- do absorpcji w nadfiolecie(detektor UV)- działa na zasadzie pomiaru pochłaniania światła z zakresu UV. Jest najlepszy i najczęściej stosowany w HPLC.

a)detektor pracuje przy określonej długości fali 254nm- 60%związków przy tej długości fali pochłania promieniowanie, źródłem promieniowania lampy lub źródła fosforescencyjne. b)- pomiar absorpcja przy określonej długości fali; bardziej zaawansowany; ale rejestrowanie widm przy zatrzymywanym przepływie kłopotliwe. Najnowsze- rejestrowanie widm bez zatrzymania przepływu przy zastosowaniu szybko analizującego spektrometru. Nie jest wrażliwy na zmiany T i przepływu.

Wada: ograniczenie zastosowania tego detektora do związków, które pochłaniają w UV- związki zawierające wiązania nienasycone = i

grupy chromo -CH=CH-; -N=N; =C=O. Należy uwzględnić absorpcję UV przez fazę ruchomą. Ważna jest granica pochłaniania w UV fazy ruchomej.

Im mniejsza długość fali granicznej ty bardziej czuły detektor. Detektory mają znacznie większą czułość w porównaniu do refraktometrów.

Detektor z matrycą diodową DAD. Matryca d- układ 211 diod, z których każda rejestruje pochłanianie przy innej długości fali. Można analizować i rejestrować pochłanianie przy dł. Fali 190-600nm.Czas analizy 10 milisekund. Detektor ten ma operację sprawdzania czystości piku - czy jeden czy dwa położone. Można korzystać z biblioteki widm. Są produkowane chromatografy cieczowe z detektorem masowym (detektor masowy wymaga próżni) → LCMS.
Detektor spektrofluorymetryczny-selektywny i charakteryzuje się dużą czułością w stosunku do związków wykazujących wł fluorescencyjne.Detektor łączy się z detektorem UV(w obu przypadkach potrzebne jest źródło światła UV).Granica oznaczalności jest ok. 100-krotnie niższa niż w detektorze UV.

SPOSOBY NAPEŁNIANIA KOLUMN
-Sucha
-mokra-przyrządza się zawiesinę wypełnienia w rozpuszczalniku o gęstości zbliżonej do wypełnienia-zawiesinę pompuje się przez kolumnę,stosując ciśnienie 50-100MPa.

Wypełnienia-o rozmiarach ziaren ok. 5-10 μm, czasami ok. 3 μm. W normalnym układzie faz- faza stacjonarna polarna ( żel krzemionkowy) , czasami stosuje się tlenek glinu. Żel krzemionkowy łatwo absorbuje wodę na swojej powierzchni- dezaktywuje się. W związku z tym fazy ruchome powinny być odwodnione. Czasami specjalnie wcześniej dezaktywuje się powierzchnię żelu krzemionkowego (adsorpcja alkoholu) lub chemicznie, taki żel można stosować do analiz alkoholi, amin, kwasów (b. polarne). Do związków mniej polarnych stosuje się żele niezdeaktywowane.

Modyfikacja żelu krzemionkowego- związana z aktywnymi grupami żelu krzem; modyfik. Się związkami organicznymi ( łańcuchy alkilowe lub łańcuchy alkilowe zakończone grupami funkcyjnymi)- fazy związane- otrzymuje się z nich wypełnienia niepolarne.

Faza oktadecylosilanowa- do analizy homologów.

W przypadku związków, które są izomerami optycznymi (mieszaniny racemiczne), stosujemy wypełnienie z dodatkami związków optycznie czynnych.

Do analizy związków jonowych stosuje się wymieniacze jonowe, a do rozdzielania na zasadzie anionów- wymieniacze anionowe, np. czwartorządowe aminy, stos. do analizy kwasów organicznych. Do rozdzielania na zasadzie wymiany kationów służą wymieniacze kationowe, np. aromatyczne kwasy sulfonowe, stos. do analizy zasad.

Temperatura - z reguły zawsze ogrzewa się kolumnę; temperatura odgrywa ważną rolę- podwyższenie temp kolumny- analiza substancji trudno rozpuszczalnych w fazie ruchomej (zwiększa się ich rozpuszczalność). W chrom jonowymiennej im wyższa temperatura tym szybsza wymiana jonowa.

Fazy ruchome - są nimi pojedyncze rozpuszczalniki lub ich 2-3 składnikowe mieszaniny. Skład eluentu może być stały - elucja izokratyczna ; lub może się zmieniać - elucja gradientowa.

Dobór fazy ruchomej:

-rodzaj składników rozdzielanej mieszaniny;

-rodzaj zastosowanego wypełnienia kolumny;

-rodzaj detektora;

-f.ruchoma nie może działać szkodliwie na rozdzielane związki i wypełnienie;

-musi dobrze rozpuszczać analizowaną mieszaninę i umożliwiać detekcję jej składników;

-stosuje się rozpuszczalniki o specjalnej czystości, nie może zawierać śladów powietrza.

Podsumowanie do normalnego i odwróconego układu faz. W normalnym układzie faz stosujemy polarne fazy stacjonarne( żel krzemionkowy),jako ruchome fazy(heksan, izooktan, chloroform, chlorek metylenu) stosowane są rozpuszczalniki o mniejszej polarności; Fazy te muszą być bezwodne. W odwróconym układzie faz: faza stacjonarna jest słabo polarna lub niepolarna (wypełnienia chemicznie związane C18,C8,C2), faza ruchoma jest bardziej polarna(tetrahydrofuran, autonitryl, metanol, woda). Robiąc mieszaniny z wodą ↑ilość wody powoduje wydłużenie tr substancji niepolarnych, a wzrost rozpuszczalnika nieorganicznego powoduje skrócenie tr.

Dobór mieszaniny do rozdziału. W normalnym układzie faz zbyt długi czas retencji można skrócić stosując eluent bardziej polarny, który w tym układzie będzie miał większa siłę elucji. W odwróconym ukł.faz długo tr można skrócić stosując eluent mniej polarny, np.wodny roztwór o mniejszej zawartości metanolu, o większej sile elucji. Zmianę składu rozpuszczalnika stosujemy w elucji gradientowej. W czaise rozdzielania składników jednej próbki skład eluentu zmienia się, a jego siła elucji zwiększa się. Zmiana składu mieszaniny stosowanej jako faza ruchoma może być liniowa lub przebiegać np. skokowo.

Dobór składu fazy ruchomej. Analizę niepolarnych związków np.weglowodorów, ich pochodnych chlorowcowych lub związków zawierających rodniki, czyli związków dobrze rozpuszczalnych się w heksanie, wykonuje się w odwróconym układzie faz. Jako fazę ruchomą stosuje się mieszaninę 0-30%wody w metanolu lub acetonitrylu. Substancje o pośredniej polarności rozpuszczają się w estrach, alkoholu i chloroformie. Mogą oddziaływać z grupami aktywnego żelu krzemionkowego i polarnymi grupami faz związanych. Do ich analizy stosuje się mieszaniny 2-50% organicznego rozpuszczalnika polarnego w rozpuszczalniku niepolarnym, np. w węglowodorze. Jeżeli mamy polarne związki organiczne rozpuszczalne w wodzie, często rozdzielane są w odwróconym układzie faz. Faza ruchoma zawiera2-50% rozpuszczalnika organicznego(metanol, acetonitryl) w wodzie. Jeżeli związki są substancjami jonowymi do fazy ruchomej dodaje się rozwory buforowe, sole, kwasy. Związki jonowe można analizować na wymieniaczach jonowych stosując roztwory buforowe jako eluent.

ELUCJA GRADIENTOWA- skład eluentu zmienia się podczas chromatografowania próbki.Szerokie zastosowanie podczas chromatografowania mieszanin złożonych zawierających składniki różniące się w sposób zasadniczy polarnością.Przebieg: prostoliniowy/wypukły/wklęsły.Najpierw stosuje się eluent o dużej mocy elucyjnej i stopniowo zmniejsza jego moc.
ELUCJA IZOKRATYCZNA
skład eluentu nie zmienia się
SZEREGI ELUOTROPOWE Rozpuszczalniki sklasyfikowano wg wzrastającej mocy elucyjnej w SE rozpuszczalników.Przyjmuje się że moc elucyjna rozpuszczalnika jest proporcjonalna do jego przenikalności elektrycznej i można ją wyznaczyć eksperymentalnie.Najpierw stosuje się rozpuszczalnik ze środka szeregu eluotropowego a następnie w zależności od uzyskanego efektu należy zmienić rozpuszczalnik na taki który ma większą lub mniejszą moc elucyjną.Częściej jednak do wybranego rozpuszczalnika dodaje się innego rozpuszczalnika modyfikując w ten sposób moc elucyjną mieszaniny.
ANALIZA JAKOŚCIOWA
1)identyfikacja substancji chromatografowanej metodami fizykochemicznymi 2) Korzystając z wyznaczonych doświadczalnie parametrów retencji
Wielkości retencyjne mogą służyć do identyfikacji substancji wchodzących w skład analitu gdyż są one dla niej charakterystyczne w danych warunkach analizy.Porównuje się parametry uzyskane w identycznych warunkach dla sub i dla wzorca.

ANALIZA ILOŚCIOWA

Wykorzystuje się fakt że ilość składnika jest proporcjonalna do pola powierzchni pod pikiem i do jego wysokości.

Met wzorca wew.

Do kolumny dozuje się znane rosnące objętości r-u wzorca i znaną objętość analitu.Wyznacza się wysokość lub powierzchnię piku.Na podstawie otrzymanych danych rysuje się wykres h=f(V) lub S=f(V) i odczytuje się z niego zawartość interesującej nas sub.

Met wzo zewnętrznego

Pozwala na oznaczenie jednego lub kilku składników próbki nawet jeśli nie wszystkie jej składniki są rozdzielone.Wzorcem jest substancja nieobecna w analizie.Ściśle określoną iość wzorca dodaje się do znanej ilości próbki, następnie wykonuje się rozdział na kolumnie i wykorzystuje wzór:

G-masa wzorca/próbki
f-wsp korelacyjny
A-powierzchnia piku

Chromatografia planarna- proces chromatografowania zamiast w kolumnie prowadzony jest na płaszczyźnie. Wykonuje się ją na bibule lub na cienkich warstwach sorbentów osadzonych na podłożu z płytek szklanych lub z folii aluminiowych albo polimerowych. Rozróżniamy w ten sposób chromatografię bibułową i cienkowarstwową(TLC). W chromatografii planarnej stosuje się takie same fazy ruchome jak w cieczowej chromatografii kolumnowej; dobór eluentu odbywa się na tych samych zasadach. Proces chromatografowania przeprowadza się w odpowiednich komorach chromat. Próbki rozdzielane nanosi się na płytkę w ilości 10^-4-2*10^-2 cm³; na jednej płytce można umieścić kilka próbek; płytki umieszcza się w komorze chromatograficznej, w której na dnie znajduje się rozpuszczalnik-eluent. W wyniku działania sił kapilarnych rozpuszczalnik jest wciągany w górę płytki. W wyniku ruchu rozpuszczalnika i oddziaływania substancji rozdzielanych z sorbentem następuje rozdzielenie składników na płytce i poszczególne składniki tworzą oddzielne plamki lub strefy. Im substancja bardziej oddziaływuje z fazą stacjonarną tym jej droga będzie dłuższa. Droga - charakteryzuje jakościowo związki. Analizę należy przeprowadzać w różnych warunkach.

Współczynnik opóźnienia Rf - określa położenie substancji na chromatogramie. Jest to stosunek drogi migracji substancji chromatografowanej (A) do drogi przebytej przez fazę ruchomą (B), czyli Rf=A/B. Współczynnik ten przyjmuje wartości od 0-1 i jest charakterystyczny dla danej substancji -jest taki sam w takich samych warunkach prowadzenia rozdziału chromatograficznego. Jest to odpowiednik czasu retencji.

K=(1-Rf)/Rf

K=(tr-tm)/tm stąd tr=tm(k+1)

Wizualizacja chromatogramów:

Płytkę po wyjęciu z komory wyciągamy, zaznaczamy dokąd doszedł rozpuszczalnik, jeżeli substancje analizowane są bezbarwne należy przprowadzić wizualizację: spryskuje się płytkę odczynnikami, które reagują z substancjami analizowanymi i powstaje barwny produkt.W tym celu zanurzamy płytki w odczynniku, a jeśli odczynnik jeest w fazie gazowej - w pojemniku -amoniak, pary jodu (żółte lub brązowe). Roztwory KmnO₄ w stęż.H₂SO₄ lub NaOH-utlenia związki oznaczane -na fioletowym tle brązowe plamki są produktami utleniania. Amoniakalny roztwór AgNO₃- łagodny utleniacz- plamki od pomarańczowych do czarnych.

Jeżeli analizujemy związki zawierające gr.karbonylową ,to do wizualizacji stosuje się roztwór dinitrofenylohydrazyny. Często do wizualizacji stosuje się naświetlanie światłem UV 254nm-plamki uwidaczniają się tylko,gdy płytka znajduje się w świetle UV.

ANALIZA JAKOŚCIOWA W TLC(CHROMATOGRAFII PLANARNEJ)

Opiera się na charakterystycznych reakcjach chemicznych poszczególnych plamek, a także na porównaniu współczynnika opóźnienia R_f wzorca i badanej próbki.

ANALIZA ILOŚCIOWA W TLC.

Porównanie rozmiarów lub intensywności zabarwienia plamki z analogicznymi parametrami plamek wzorców.

DENSYTOMETRIA- mierzy się intensywność zabarwienia plamki za pomocą układu optyczno-elektronicznego, otrzymując wykres w postaci densytogramu. Chromatogramy plamkowe zostają przekształcone w chromatogramy pikowe.

Istota densytometrii- światło o odpowiedniej długości fali pada wzdłuż linii rozwijania chromat. na poruszającą się płytkę. Światło jest pochłaniane różnie przez adsorbent i przez plamki- światło odbite od próbki ma różną intensywność w zależności od miejsca, na które padło. Densytogram powstaje w wyniku rejestracji zmian intensywności odbitego światła przez układ diod i zapisania po elektronicznej obróbce w postaci pików.

PŁYTKI DO CHROMATOGRAFI CIENKOWARSTWOWEJ

Warstwę fazy stacjonarnej osadza się na podłożu ze szkła, folii aluminiowej albo tworzywa sztucznego. Płytki różnią się grubością warstwy adsorbentu (analityczne-cieńszy- 0,1-0,25mm;

preparatywne- 0,5-2mm).Mogą to być płytki TLC albo wysokosprawne HPTLC z adsorbentem o drobniejszym uziarnieniu i węższych frakcjach sitowych. Produkowane są płytki zawierające czynnik fluoryzujący, oznaczane F₂₅₄. jako wskaźniki fluoryzujące- siarczek kadmu i krzemian cynku. Aby warstwa adsorbentu była trwała stosuje się środek wiążący, najczęściej gips razem ze skrobią.

Sorbenty w TLC- stosuje się takie same sorbenty jak w chromatografii kolumnowej: polarne hydrofilowe, lipofilowe, średniopolarne, normalny układ faz- żel krzemionkowy, odwrócony układ faz- fazy związane chemicznie, poliamid.

Komory: poziome, pionowe, ciśnieniowe.

Porównanie chromatografii cieczowej kolumnowej z TLC. Techniki te są dla siebie konkurencyjne. Zalety TLC w porównaniu do HPLC: analiza TLC nie wymaga szczególnego przygotowania próbki, zanieczyszczenia nie przeszkadzają, płytkę wykorzystuje się tylko raz; nie trzeba zatężać próbki, na TLC- kilkakrotnie nanosimy próbkę. W TLC można próbki nanosić na płytkę w dużej objętości Mogą być próbki rozcieńczone, bo rozpuszczalnik będzie usuwany. Na jednej płytce można analizować kilkanaście próbek jednocześnie. Metoda bardzo szybka. Nie trzeba zwracać uwagi na to, żeby faza ruchoma była odpowiednio dobrana do detektora. Jeżeli analizujemy substancje barwne można zobaczyć rozdział. Cena analizy TLC 20% ceny analizy HPLC. HPLC jest jednak bardziej dokładna niż TLC.

Technika TLC odgrywa dużą rolę w laboratoriach biochemicznych do identyfikacji białek, polipeptydów, aminokwasów i kwasów nukleinowych. Na płytkach cienkowarstwowych można uzyskać „mapy” aminokwasów uzyskane z hydrolizatorów białkowych, które mają istotne znaczenia w diagnostyce medycznej. Jest też stosowana w laboratoriach farmaceutycznych i do kontroli żywności.

TECHNIKI ROZWIJANIA

Dośrodkowe- Przygotwuje się płytkę o wielkości zaleznej od ilości nanoszonych próbek.Nie zaznacza się lini startu ani końca. Probki nanosi się w pobliżu krawędzi płytki a fazę ruchomą doprowadza się między okręg utworzony przez plamki a krawędz płytki. Eluent migruje do środka płytki. Powierzchnia plamek zmniejsza się w trakcie procesu co pozwala wykryć minimalne ilości sub.

Dwukierunkowe-W przypadku złożonych mieszanin których składniki nie rozdzielają się po 1-krotnym chromatografowaniu stosuje się rozwiajnie dwukierunkowe prostopadłe. Na linię startu nanosi się próbki i prowadzi standardowe rozwiajnie chromatogramu.Po zakończeniu płytkę suszy się i obraca o 90st. Następnie prowadzi się kolejny rozdział za pomocą innego eluentu dzięki czemu rozdzieleniu ulegają te składniki próbki które nie rozdzieliły się przy pierwszym chromatografowaniu.

Odśrodkowe-

-dla 1 substancji-na śdorek płytki doprowadza się próbkę i eluent-powstają okręgi rozdzielanych substancji
-dla kilku sub- na środek doprowadza się eluent a w niewielkiej odległości od niego po okręgu nanosi się próbki analizowanych substancji

Sposoby nanoszenia próbek: automatyczne aplikatury, mikropipety, mikrostrzykawki.

ZASTOSOWANIE TLC

-identyfikacja złożonych mieszanin-analiza jakościowa opiera się na charakterystycznych reakcjach chemicznych poszczególnych plamek,a a także na porównianiu Rf wzorca i badanej próbki.

-identyfikacja białek,polipeptydów,aminokwasów i kwasów nukleinowych-na płytce TLC można otrzymać `mapy' aminokwasów uzyskane hydrolizatów białkowych

-analiza ilościowa-porównywanie rozmiarów lub intensywanosći zabarwienia plamki próbki z analogicznymi parametrami plamek wzorca

---