Izolacja całkowitego RNA - KONSPEKT, studia - biotechnologia, biologia molekularna


Doświadczenie 4

Izolacja całkowitego RNA.

Ilościowa i jakościowa ocena preparatów RNA

Cel doświadczenia:

Zapoznanie się z metodyką izolacji RNA z materiału biologicznego, specyfiką pracy z RNA oraz z ilościową i jakościową oceną preparatów RNA.

Wymagane wiadomości:

Budowa chemiczna i właściwości fizykochemiczne kwasów nukleinowych. Funkcje biologiczne kwasów nukleinowych.

Uwaga!

Podczas izolacji RNA należy pamiętać o tym, że zanieczyszczenie próbki może się wiązać z wprowadzeniem RNaz (głównie z naskórka rąk), a więc z degradacją RNA i niepowodzeniem całej procedury.

Sprzęt i materiały:

- Tkanka zwierzęca

- homogenizator szklany

- wirówka z chłodzeniem

- pipety

- końcówki do pipet (wolne od RNaz - autklavowane)

- probówki eppendorfa 1,5 ml (wolne od RNaz)

- PCR-ówki wolne od RNaz

- Spektrofotometr NanoDrop 500

- rękawiczki

- zestaw do elektroforezy kwasów nukleinowych

- transilumiantor

Odczynniki:

- zestaw do izolacji całkowitego RNA - GeneMATRIX Universal RNA Purification Kit

- alkohol etylowy 95% lub denaturat do przemywania blatów

- agaroza

- paraformaldehyd

- bufor TBE

- obciążnik RNA (RNA leader)

- Bromek etydyny

Wykonanie:

Izolacja RNA zostanie przeprowadzona zgodnie z protokołem GeneMATRIX Universal RNA Purification Kit

  1. Rozdrobnić fragment tkanki mechanicznie w 400 μl buforu RL za pomocą homogenizatora szklanego

  2. Wirować próbkę przez 3 min. z prędkością…

  3. Ostrożnie przenieść supernatant do mikrokolumny homogenizacyjnej umieszczonej w 2 ml probówce odbierającej. Wirować przez 2 min. z prędkością…

Uwaga: Wirowanie przez minikolumnę homogenizacyjną filtruje i homogenizuje lizat oraz eliminuje DNA.

  1. Dodać 350 μl 70% alkoholu etylowego do przesączu. Wymieszać dokładnie przez pipetowanie. Nie wirować.

Uwaga: Po dodaniu etanolu może strącić się osad.

  1. Przenieść mieszaninę (razem z osadem, jeżeli powstał) do minikolumny wiążącej umieszczonej w probówce odbierającej. Wirować przez 1 min. z prędkością 11000 x g. Wylać przesącz.

  1. Dodać 400 μl buforu płuczącego Wash DN1 do minikolumny. Wirować przez 1 min. z prędkością 11000 x g.

  1. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i powtórnie umieścić minikolumnę w probówce.

  1. Dodać 650 μl buforu płuczącego Wash RBW do minikolumny. Wirować przez 1 min. z prędkością 11000 x g.

  1. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i powtórnie umieścić minikolumnę w probówce.

  1. Dodać 350 μl buforu płuczącego Wash RBW do minikolumny. Wirować przez 2 min. z prędkością 11000 x g.

  1. Minikolumnę umieścić w nowej probówce typu Eppendorf 1,5-2 ml (dokładnie opisać). Dodać 60 μl wody RNase-free centralnie na membranę.

  1. Wirować przez 1 min. z prędkością 11000 x g.

  1. Usunąć minikolumnę, zamknąć probówkę. RNA jest gotowe do dalszych analiz/manipulacji, może być przechowywane w temp. -20 lub -80 oC (należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania RNA).

  1. Odpipetować do 2 PCR-ówek po 10 μl RNA.

  1. 1 PCR-ówkę z RNA zostawiamy na lodzie - do oznaczenie ilości i czystości RNA oraz rozdziału na żelu agarozowym. Pozostałe RNA zamrażamy w temp. -20oC.

  1. Oznaczyć stężenie i czystość RNA przy użyciu spektrofotometru NanoDrop.

  1. Przygotować 1% żel agarozowy

2


Wyszukiwarka