SPRAWOZDANIE ćw. 2.

Amplifikacja genu metodą PCR, trawienie enzymami restrykcyjnymi

Tomasz Koliński, gr. 2.

• Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej:

1. woda destylowana 4,4 μl

2. jony Mg²⁺ 1,6 μl

3. bufor 2 µl

4. mieszanina dNTP 1,0 μl

5. primer 1 5,0 μl

6. primer 2 5,0 μl

7. matrycowe DNA 2,5 μl

8. polimeraza DNA 0,1 μl

Kolejno dodano ww. składniki, w podanych ilościach. Probówka znajdowała się w lodzie.

• Reakcja amplifikacji DNA

Reakcja amplifikacji zachodziła w termocyklerze (ilość cykli - 29), w następujących etapach:

denaturacja wstępna - 95^oC, 2 min

cykl PCR:

denaturacja - 95^oC, 30 sekund

łączenie primera - 60^oC, 30 sekund

wydłużanie - 72^oC, 4 min

końcowe wydłużanie - 72^oC, 20 min

Amplifikowano gen rIII

• Trawienie restrykcyjne - kolejność dodawania:

1 μl enzym I

1 μl enzym II

2 μl bufor R

2 μl DNA

14 μl H₂O

Trawienie w 37^o C przez ok. 2 godziny.

Trawiono plazmid pCattTrE18. Część grupy wykorzystała enzymy: BseHI oraz BamHI, a pozostała część grupy: PstI oraz HindIII.

• Analiza produktu amplifikacji

Przygotowano agarozę 1% w buforze 0.5x TBE.

Wylano żel w odpowiednim aparacie, poczekać do zastygnięcia agarozy.

Do komór aparatu nalano bufor 0.5x TBE , tak aby pokrywał on powierzchnię żelu.

Do studzienek żelu naniesiono matrycę („drabinę”) i próbki DNA - po 10 μl z każdej reakcji PCR zmieszane z buforem obciążającym w proporcji 5:1.

Rozdział prowadzono przy stałym napięciu 5V/cm długości żelu.

Żel barwiono w roztworze bromku etydyny i oglądano w świetle ultrafioletowym.

Uzyskany obraz:

• w pierwsze ścieżce - drabina,

• w kolejnych - produkty trawienia restrykcyjnego.