Zacznijmy od tego, co to jest PCR. Reakcja łańcuchowa polimerazy (w skrócie PCR) jest to reakcja służąca do amplifikacji (namnożenia) wybranego fragmentu DNA in vitro czyli w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki.
Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery (primery) oraz termostabilną polimerazę (np. polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z bakterii Pyrococcus furiosis oraz inne polimerazy, będące z reguły modyfikacjami wyżej wymienionych). Startery (primery) są krótkimi (zazwyczaj 18-24 nukleotydów długości), jednoniciowymi fragmentami DNA, które łączą się z komplementarnym fragmentem DNA i umożliwiają polimerazie DNA rozpoczęcie reakcji.
Pierwszym etapem reakcji jest denaturacja podwójnej helisy DNA, która zachodzi w temperaturze ok. 95˚C. Następnie temperatura jest obniżana do ok. 50˚C, co umożliwia połączenie się starterów z komplementarnymi sekwencjami. W końcu, temperatura jest podnoszona do ok. 72˚C, następuje przyłączenie się kompleksu z polimerazą DNA i rozpoczyna się reakcja polimeryzacji, w wyniku której powielany jest fragment zawarty pomiędzy dwoma primerami. Ta sekwencja cykli jest powtarzana wiele razy, w zależności od ilości materiału, który chce się uzyskać.
Metoda PCR znajduje wiele zastosowań, m.in.
- Klonowanie genów,
- Diagnostyka kliniczna,
- Identyfikacja osób zaginionych,
- Kryminalistyka,
- Prace nad gatunkami, które wyginęły.
Stosuje się również modyfikacyjne metody PCR którą jest między innymi PCR-DGGE, czyli elektroforeza w żelu z gradientem czynnika denaturującego (ang. Denaturating Gradient Gel Electrophoresis - DGGE). Jest to jedna z metod identyfikacji i badań mikroorganizmów jak również przesiewowego wykrywania mutacji punktowych.
Badany DNA jest uzyskuje się z zastosowaniem metody amplifkacji PCR z zastosowaniem specjalnych starterów bogatych w sekwencje GC (ang. GC clamp);
W trakcie elektroforezy dwuniciowego DNA w żelu poliakrylamidowym o wzrastającym stężeniu związku denaturującego (formamid, mocznik) niektóre fragmenty DNA ulegają niepełnemu rozdzieleniu na pojedyncze nici (denaturacja) przy niższym, a inne fragmenty przy wyższym stężeniu czynnika denaturującego;
Całkowitemu rozdzieleniu się podwójnej nici zapobiegają fragmenty GC clamp;
W momencie rozdzielania się nici (denaturacja) ich przemieszczanie w żelu zostaje gwałtownie przyhamowane, więc im silniejsze wiązanie obu nici DNA, tym dalej wędruje w żelu denaturacyjnym. Moment denaturacji fragmentu DNA zależy od jego budowy (składu zasad i długości) co umożliwia określenie z jakim organizmem mamy do czynienia.