ĆWICZENIE 1

Izolacja kwasów nukleinowych z materiału ludzkiego

Ćwiczenie ma na celu zapoznanie uczestników z metodami izolacji DNA z komórek ludzkich (DNA genomowy). Celem izolacji jest uzyskanie dużej ilości oczyszczonego preparatu DNA, pozbawionego białek oraz inhibitorów enzymów wykorzystywanych w reakcji PCR. Najlepszą metodą izolacji materiału genetycznego jest metoda fenolowo-chloroformowa. Uzyskane tą metoda ekstrakty mogą zostać wykorzystane jako matryca dla reakcji PCR, a także poddane sekwencjonowaniu, klonowaniu oraz analizie restrykcyjnej. W związku z tym, że fenol jest odczynnikiem toksycznym najczęściej wybiera się metody, w których nie ma potrzeby użycia szkodliwych dla zdrowia substancji. W trakcie zajęć uczestnicy zapoznają się zarówno z metodami izolacji opartymi o ekstrakcję materiału genetycznego w fazie ciekłej (pkt. 1 i 3), jak również z wykorzystaniem nośnika stałego (pkt. 2).

Uzyskane roztwory DNA poddane zostaną rozdziałowi w żelu agarozowym w celu oceny jakości uzyskanego preparatu. Wyizolowany materiał posłuży jako matryca dla reakcji PCR w kolejnych ćwiczeniu.

Metody izolacji DNA

1. Izolacja DNA genomowego (metoda w roztworze)

Materiał stanowi zamrożona krew ludzka z kolekcji własnej Pracowni Diagnostyki Molekularnej.

1. Przenieść 200 µl krwi do jałowej 1.5 ml probówki typu Eppendorf (nie załączono w zestawie).

2. Przeprowadzić lizę komórek poprzez dodanie 5 objętości buforu zawierającego NH₄Cl (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM Tris-HCl, pH 7.4), a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. W celu uzyskania osadu jąder komórkowych lizat wirować przy 10 000 rpm przez 10 min.

3. Otrzymaną frakcję jądrową przemyć 1 ml PBS (wirowanie 10 000 rpm przez 4 min.) i zawiesić w 750 µl buforu TE. Otrzymany lizat można przechowywać w -20ºC przez wiele lat.

4. Ekstrahować DNA z fazy wodnej, dodając równa objętość mieszaniny fenol:chloroform wysyconego buforem TE do pH 8.0. Wskazane jest delikatne wytrząsanie probówki przez 10 min.

5. Rozdzielić fazy poprzez łagodne wirowanie przy 2500 rpm przez 5 min.

6. Zebrać fazę wodną (starać się nie zaciągnąć pipetą białego osadu znajdującego się na granicy faz) i ponownie ekstrahować równą objętością mieszaniny fenol:chloroform.

7. Rozdzielić fazy poprzez łagodne wirowanie przy 2500 rpm przez 5 min.

8. Zebrać fazę wodną do nowej probówki , następnie dodać 0.1 objętości octanu amonu i 1 objętość izopropanolu w celu wytrącenia DNA (w przypadku gdy materiał ma być wykorzystywany do klonowania używamy 0.1 objętości octanu sodu i 2.5 objętości alkoholu etylowego).

9. Precypitacja 20 min, -20°C (w przypadku małych cząsteczek DNA).

10. Odwirować przy 12000 rpm przez 10 min, osad przepłukać 75% etanolem (500 µl), odwirować (4 min, prędkość maksymalna). Po wysuszeniu (37°C przez 15 - 20 min.) osad rozpuścić w 40 µl wody dejonizowanej lub buforu TE (10 mM TRis-HCl, 2 mM EDTA, pH 8).

2. Izolacja ludzkiego DNA genomowego (metoda kolumienkowa) z krwi obwodowej (Blood Mini Kit, A&A Biotechnology)

• Procedura zgodna z protokołem producenta

Uwagi

1. Zestaw przeznaczony jest do izolacji DNA z 0.1-1 ml krwi świeżej lub mrożonej.

Pojemność minikolumny do oczyszczania DNA wynosi 20 μg.

2. Proteinaza K znajdująca się w zestawie jest roztworem gotowym do użycia, który należy przetrzymywać w temperaturze 2-8°C. Data ważności znajduje się na etykietce.

3. Jeżeli roztwór LT zawiera precypitat należy go podgrzać do temperatury 40°C w celu

całkowitego rozpuszczenia osadu przed użyciem.

Przygotowanie materiału

A. 100 μl krwi świeżej lub mrożonej

1. Pobrać do probówki 100 μl krwi świeżej lub mrożonej. W przypadku mniejszych

objętości krwi dodać buforu Tris do całkowitej objętości 100 μl .

2. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA.

B. 0.2-1 ml krwi świeżej lub mrożonej

1. Pobrać do probówki odpowiednią ilość krwi i dodać połowę objętości roztworu.

lizującego erytrocyty LE (np. do 500 μl krwi dodać 250 μl roztworu LE).

2. Całość wymieszać przez odwracanie probówki, a roztwór z mętnego zmieni sie w

szkarłatnie przezroczysty.

3. Próbkę wirować trzy minuty przy 10-15 tys. rpm.

4. Po wirowaniu usunąć pipetą supernatant, a do osadu stanowiącego frakcję białych

krwinek dodać 100 μl buforu Tris i dokładnie zawiesić go przez pipetowanie.

5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA.

Protokół izolacji DNA

1. Dodać 200 μl uniwersalnego buforu lizującego LT i 20 μl Proteinazy K. Całość

wymieszać i inkubować 20 min. w temperaturze 37° C.

2. Próbkę intensywnie worteksować 20 sek. i nanieść na minikolumnę do oczyszczania

genomowego DNA.

3. Wirować 1 min. przy 10-15 tys. rpm.

4. Wyjąć minikolumnę wraz z probówką i dodać 500 µl roztworu płuczącego A1.

5. Wirować 1 min. przy 10-15 tys. rpm.

6. Przenieść minikolumnę do nowej probówki 2 ml (w zestawie) i dodać do kolumny 400 μl roztworu płuczącego A1.

7. Wirować 2 min. przy 10-15 tys. rpm.

8. Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej probówce 1.5 ml i dodać do niej 50 μl

buforu Tris (10mM Tris-HCl pH 8,5).

9. Inkubować próbkę 5 min. w temperaturze pokojowej.

10. Wirować 1 min. przy 10-15 tys. rpm.

11. Minikolumnę usunąć, a oczyszczone DNA znajdujące sie w probówce przechowywać

w lodówce do czasu dalszych analiz.

3. Izolacja ludzkiego DNA genomowego (metoda kolumienkowa) ze śluzówki nabłonka ludzkiego (SWAB, A&A Biotechnology)

Materiał genetyczny będzie izolowany w trakcie ćwiczeń.

• Procedura zgodna z załączonym protokołem firmy

Uwagi

1. Pojemność minikolumny do oczyszczania DNA wynosi 10 μg.

2. Proteinaza K znajdująca się w zestawie jest roztworem gotowym do użycia.

Zachowuje ona swoją aktywność przez 12 miesięcy. Proteinazę należy

przetrzymywać w temperaturze +4°C. Data ważności znajduje się na etykietce.

Protokół izolacji DNA

1. Przygotować odpowiednią ilość probówek typu Eppendorf o pojemności 1.5 ml (nie załączono zestawie).

2. Pobrać wymaz, odciąć część patyczka wymazowego z pobrania próbki i umieścić go w probówce (odcięta część powinna całkowicie mieścić się w probówce).

3. Dodać 0.7 ml roztworu lizującego i 20 μl Proteinazy K.

4. Całość wymieszać i inkubować w temperaturze 37°C przez 20 minut. Próbkę należy mieszać od czasu do czasu poprzez worteksowanie.

5. Pobrać roztwór z probówki i nanieść na kolumnę do oczyszczania DNA.

6. Wirować 1 min. przy 10-15 tys. rpm.

7. Przenieść kolumnę do probówki 2 ml (znajduje się w zestawie) i dodać 0.5 ml roztworu płuczącego A1.

8. Wirować 1 min. przy 10-15 tys. rpm.

9. Przenieść kolumnę do nowej probówki 2 ml (znajduje się w zestawie) i dodać 0.5 ml

roztworu płuczącego A1.

10. Wirować 2 min. przy 10-15 tys. rpm.

11. Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej probówce 1.5 ml (nie załączono w zestawie) i dodać na dno kolumny 50 μl buforu elucyjnego (10mM TRIS.HCl, pH 8.5) lub wody, uprzednio ogrzanych do temperatury 75°C

12. Inkubować 3 minuty w temperaturze pokojowej.

13. Wirować 1 min. przy 10-15 tys. rpm.

14. Minikolumnę usunąć, a oczyszczone DNA znajdujące się w probówce

przechowywać w lodówce do czasu dalszych analiz.

Dodatkowe uwagi:

1. Szybkość przepływu przez kolumnę zależy bezpośrednio od jakości i wielkości cząsteczek DNA. Duża zawartość wysokocząsteczkowego DNA zmniejsza szybkość przepływu. Jeśli ilość DNA w naniesionej próbce przekracza 20 µg, wówczas przepływ może zostać zatrzymany. W takim przypadku należy kolumnę umieścić w probówce (15 ml) i zwirować w rotorze uchylnym przy 3 000 - 4 000 rpm przez 1 minutę. Wirowanie takie można przeprowadzić zarówno po naniesieniu roztworu wyjściowego na kolumnę, jak i kolejnych roztworów płuczących.

2. Procedura chromatograficznego oczyszczania DNA może być przerwana na każdym etapie, pod warunkiem, że DNA znajduje się na złożu. Proces oczyszczania można kontynuować nawet po 15-godzinnej przerwie bez straty ilości i jakości oczyszczanego DNA. W czasie przerwy w oczyszczaniu DNA probówka powinna być zamknięta, co zabezpiecza złoże przed osuszeniem i utratą DNA.

4. Pomiar stężenia DNA metodą spektrofotometryczną oraz ocena jakości uzyskanego DNA w żelu agarozowym.

Pomiar stężenia DNA wykonany zostanie metodą spektrofotometryczną z wykorzystaniem urządzenia typu Nano-Drop™, umożliwiającego pomiar w bardzo niewielkiej objętości próbki (2μl).

Przygotowanie 1% żelu agarozowego: 1 g agarozy rozpuścić przez doprowadzenie do wrzenia w 100 ml buforu TBE (0,5x stęż) lub TAE (1x stęż). Kiedy temperatura żelu wynosi ok. 45°C dodać bromek etydyny do ostatecznego stężenia 5 ug/ml, a następnie wylać na płytę aparatu do elektroforezy. Po zestaleniu żelu nanieść próbki DNA zawierające barwnik obciążający. Prowadzić rozdział fragmentów DNA prądem o napięciu 5 V/cm żelu. Po rozdziale oglądać żel w świetle UV (365 nm).

Bromek etydyny jest silnym mutagenem i umiarkowanie silną trucizną. Należy stosować rękawiczki pracując z roztworami zawierającymi bromek etydyny.

Promieniowanie ultrafioletowe (UV) jest niebezpieczne. Żele należy oglądać w świetle UV po przykryciu ich szklaną (lub inną odporną na UV) płytką oraz zakładać okulary.

---