Doświadczenie 3

Western Blot

Cel doświadczenia:

Zapoznanie się z metodą rozdziału elektroforetycznego białek.

Wymagane wiadomości:

Western Blot -zasada metody, wykorzystanie. Barwienie żeli po elektroforezie. Rodzaje membran, rodzaje transferów.

Sprzęt i materiały:

- nie barwiony żel poliakrylamidowy z rozdzielonymi białkami (może być przechowywany przez noc w temp. 4^oC, zabezpieczony wilgotną bibułą i folią)

- Membrana nitrocelulozowa

- bibuła Whatman

- transblotter

- zasilacz

- kołyska laboratoryjna

- Przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w TBST

Odczynniki:

- bufor do transferu

- TBS

- TBST

- odtłuszczone mleko w proszku lub BSA

- przeciwciała pierwszorzędowe

- przeciwciała drugorzędowe (sprzężone z peroksydazą chrzanową)

Wykonanie:

Przygotowanie membran do transferu i układanie transferu

1. Przygotować pojemnik z buforem do transferu (umieścimy w nim żel)

2. Bezpośrednio po elektroforezie wyciągamy kasetki z żelem

3. Otwieramy delikatnie kasetkę i nacinamy żel żyletką w miejscu, w którym zaczynaliśmy nakładanie próbek (początek żelu), obcinamy zbędne boki i front żelu (niebieski prążek/pasek na dole)

4. Resztę żelu ściągamy delikatnie i umieszczamy w buforze do transferu (buzią do góry) i wytrząsamy ok. 20-30 min.

5. Międzyczasie należy namoczyć 4 gąbki, 4 bibuły i 2 membrany nitrocelulozowe

UWAGA: Nie dotykać membrany palcami, używać rękawiczek i pęset. Nie pozwolić membranie wyschnąć. Obchodzić się z nią delikatnie!

- 5 gąbek - 30 min. - bufor do transferu

- 4 bibuły (filter paper) - 30 min. - bufor do transferu

- 2 membrany nitrocelulozowe - 15 min. - woda destylowana; 15 min- bufor do transferu

6. Układanie blotów/kanapek (w pojemniku do elektroforezy) - Przy układaniu transferu należy uważać, by nie tworzyły się pęcherze powietrza pomiędzy kolejnymi warstwami.

- 2 gąbki

- 1 bibuła (rolujemy zwykłą szklaną probówką lub pipetą, żeby nie było banieczek powietrza)

- żel 1 (wyrównujemy go delikatnie buforem do transferu)

- membrana nitrocelulozowa 1

- 1 bibuła (rolujemy probówką)

- 1 gąbka

- 1 bibuła

- żel 2

- membrana nitrocelulozowa 2

- 1 bibuła

- 2 gąbki

7. Umieścić całość w pojemniku do transferu

8. Zalać buforem do transferu (można dodatkowo umieścić w pojemniku z lodem)

9. Nałożyć pokrywy i przeprowadzić transfer przez ok. 2 h przy stałym napięciu 25V i natężeniu 100 mA (sprawdzić, czy bufor się nie nagrzewa)

10. Po zakończeniu transferu żel wybarwić a membranę przenieść do roztworu blokującego

Barwienie żeli i membran

1. Ściągamy bloty

2. Żel umieścić w pojemniku napełnionym wcześniej roztworem Coomasie Blue na 20 min. Następnie zlać barwnik do butelki i zlać roztworem odbarwiającym i wytrząsać ok. 20 min.

3. Umieścić membranę nitocelulozową w pojemniku z TBS a następnie w pojemniku z barwnikiem Ponceau i wytrząsać 5 min.

4. Wylać barwnik i przepłukać membranę wodą destyl. (z tryskawki) kilkakrotnie aż się membrana odbarwi.

5. Umieścić w TBST na 15 min.

Blokowanie i inkubacja z przeciwciałem (Immunobloting)

1. Umieścić membranę (zawsze czołem do góry!) w pojemniku z roztworem blokującym (10% roztwór BSA lub mleka w TBST) na 20-30 min.

2. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (anty-BDNF-rabbit) przez 1 godz., najlepiej całą noc (przeciwciało zostało rozcieńczone 1:500, tj. 10μl przeciwciała na 5 ml 5% roztworu BSA lub mleka w TBST) - w lodówce

UWAGA: W celu zmniejszenia zużycia przeciwciał używać jak najmniejszej objętości buforów, pamiętać jednak, że konieczne jest całkowite zanurzenie membrany.

3. Płukać 4x po 10 min. w TBST

4. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (Anty-rabbit HRP) przez 30 min. (przeciwciało zostało rozcieńczone 1:25000, tj. 1μl przeciwciała na 25 ml 5% roztworu BSA lub mleka w TBST)

5. Płukać membranę 4x po 5 min. w TBST

6. Podczas ostatniego płukania przygotować ligninę i wywoływacz.

7. Dokonać detekcji metodą ECL

BDNF - Brain Derived Neurotrophic Factor (czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego, 14,3 kDa) -niskocząsteczkowe białko troficzne wydzielaneprzez neurony, które reguluje przeżywalność komórki nerwowej i jejczynność za pośrednictwem receptorów błonowych TrkB i p75. BDNF reguluje
syntezę dendrytyczną niektórych białek i podlega regulacji przez aktywność neuronalną.

Kontrola jakości - określenie zawartości β-aktyny (42 kDa) w próbkach tkankowych

1. Płukać membranę intensywnie 4x po 10 min. w TBST

2. Blokować w 10% roztwórze BSA lub mleka w TBST przez 20-30 min.

8. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (anty-B-actin-mouse) przez 20-30 min. (przeciwciało zostało rozcieńczone 1:1000, tj. 10μl przeciwciała na 10 ml 5% roztworu BSA lub mleka w TBST)

3. Płukać 4x po 10 min. w TBST

9. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (anty-mouse HRP) przez 30 min. (przeciwciało zostało rozcieńczone 1:25000, tj. 1μl przeciwciała na 25 ml 5% roztworu BSA lub mleka w TBST)

4. Płukać membranę 4x po 5 min. w TBST

5. Podczas ostatniego płukania przygotować ligninę i wywoływacz.

6. Zalać roztworem wywoływacza na ok. 5 min. następnie osuszyć na ligninie.

7. Dokonać detekcji metodą ECL

1. Bufor do transferu, pH 8.3 !!!:

• 1.52 g Trizma base 25mM

• 7.2 g Glycine 192mM

• 100 ml metanolu

• dopełnić wodą do 0.5 L

2. TBS:

• 6.35 g TRIZMA HCl

• 1.18 g TRIZMA base

• 4.5 g NaCl

• dopełnić wodą do 0.5 L

3. TBST:

• 1l TBS

• 1 ml Tween 20

Roztwory 1-3 przechowywać w lodówce

Barwienie żeli:

4. Coomassie stain, 250 mL

0.25 g Coomassie Blue R-250

112 ml metanolu

112 ml H₂O

25 ml kwasu octowego (lodowatego)

5. Roztwór odbarwiający, 0.5 L

50 ml metanolu

50 ml kwasu octowego (lodowatego)

400 ml H₂O

Barwienie nitrocelulozy:

6. 0,5 % Ponceau S w 1% kwasie octowym

0,5 g Ponceau

1 ml kwasu octowego

Dopełnić do 100 ml wodą

Roztwory 4-6 przechowywać w temp. pokojowej.

1

---