Ćwiczenie 1

Wprowadzenie do zagadnień immunologii

Narządy ośrodkowe układu odpornościowego - odgrywają rolę w czynnościowym dojrzewaniu limfocytów; są to:

• Grasica - narząd limfonabłonkowy

• otoczona torebką łącznotkankową

• składa się z dwóch płatków, a każdy z wielu płacików, w których możemy wyróżnić:

• część korową - oddzielone od siebie przegrodami łącznotkankowymi

• część rdzenną - łączące się ze sobą; widoczne są tutaj ciałka grasicze (Hassala) zbudowane z koncentrycznie ułożonych komórek nabłonkowych, zachodzących na siebie dachówkowato w części obwodowej, oraz tworzących zrąb nabłonkowy w części centralnej, gdzie komórki mogą ulegać martwicy

• zrąb grasicy tworzą:

• torebka i przegrody łącznotkankowe

• komórki tworzące w miąższu sieć, mające na swej powierzchni cząsteczki głównego układu zgodności tkankowej w dużym stężeniu

• endodermalne komórki nabłonkowe

• podtorebkowe i okołonaczyniowe

• korowe → w zewnętrznej warstwie kory, gdzie obserwuje się intensywną proliferację tymocytów, ściśle je otaczają i zwane są komórkami opiekuńczymi (jedna komórka może kontaktować się z ok. 200 tymocytami)

• rdzeniowe

• komórki ciałek grasiczych

• makrofagi → pochłaniają tymocyty będące na różnych etapach dezintegracji

• komórki dendrytyczne → występują tylko w rdzeniu i na granicy kory i rdzenia

• w okach sieci komórek zrębu leżą tymocyty (limfocyty grasicze), które dostają się do grasicy w życiu płodowym najpierw z wątroby, potem ze szpiku; proliferują w zewnętrznej warstwie kory, przesuwając się do warstwy wewnętrznej i opuszczając grasicę przez żyłki pozawłosowate

• bariera krew-grasica → naczynia krwionośne wnikają do kory od strony torebki, na granicy kory i rdzenia tworzą gęstą sieć naczyń włosowatych, a w rdzeniu przechodzą w naczynia pozawłosowate; w korze naczynia otoczone są przestrzenią okołonaczyniową (w której obecne są makrofagi) i otoczką zbudowaną z komórek nabłonkowych, które utrudniają kontakt obcych antygenów z dojrzewającymi w korze limfocytami T; nie obserwuje się tej bariery w rdzeniu

• hormony grasicy wydzielane są przez komórki nabłonkowe i należą do nich: tymozyna (α1 stymuluje powstawanie limfocytów T_h; α7 stymuluje powstawanie limfocytów T_reg), grasiczy czynnik humoralny, tymopoetyna, tymulina, tymopentyna i tymostymulina; ponadto w grasicy w niewielkich ilościach wydzielane są: PRL, ADH, oksytocyna

• inne czynniki wytwarzane w grasicy to: IL-1 → IL-12 (najważniejsza dla dojrzewania limfocytów T jest IL-7!), IL-15, czynniki tworzenia kolonii (G-CSF, M-CSF, GM-CSF), TNF, TGF-β, SCF (czynnik komórek macierzystych), LIF (czynnik hamujący białaczkę)

• GH i TSH stymulują wzrost grasicy; hormony steroidowe (np. płciowe w czasie pokwitania, czy kory nadnerczy w następstwie ciężkich chorób i stresów) indukują inwolucję, polegającą na zastępowaniu obszarów limfoepitelialnych przez tkankę tłuszczową, tkankę łączną i przestrzenie okołonaczyniowe; rozpoczyna się pod koniec pierwszego roku życia i postępuje w tempie ~3% rocznie, a od wieku średniego <1%

• Kaletka Fabrycjusza - narząd limfopoetyczny występujący u ptaków, będący uchyłkiem kloaki; funkcja przypomina grasicę, umożliwia jednak dojrzewanie limfocytów B, nie T

• Szpik kostny - pełni funkcji krwiotwórcze (wytwarzanie erytrocytów, granulocytów, monocytów i płytek krwi), ponadto u ssaków odpowiedzialny jest za wytwarzanie limfocytów B; również w szpiku powstaje większość przeciwciał krwi, ponieważ wywodzące się z limfocytów B plazmocyty osiadają ponownie w szpiku (duża część powstaje też w miazdze czerwonej śledziony)

Narządy obwodowe układu odpornościowego - po opuszczeniu narządów centralnych limfocyty T lokują się głównie w tzw. obszarach grasiczozależnych obwodowych narządów limfatycznych (np. strefa parakortykotalna węzła limfatycznego czy też skupiska limfocytów wokół tętniczek pozabeleczkowych śledziony), a limfocyty B głównie w obszarach garsiczoniezależnych (np. grudki limfatyczne); wyróżniamy:

• Grudki limfatyczne nieotorbione → pobudzane przez antygeny płynów tkankowych

• występują pojedynczo lub w grupach w tkance łącznej wiotkiej, najczęściej w ścianie przewodu pokarmowego, dróg oddechowych i narządów moczowo-płciowych, gdzie leżą w bezpośrednim sąsiedztwie nabłonka i uczestniczą w wytwarzaniu limfocytów

• po pobudzeniu antygenem, w środku grudki pojawia się przejaśnienie - centrum rozmnażania, kontrastujące z ciemnym obwodem grudki - pasmem zagęszczania

• wyróżniamy:

• plamki mleczne → skupiska limfocytów i makrofagów w błonie surowiczej jamy otrzewnej i opłucnej, szczególnie dobrze widoczne w sieci wielkiej; od grudek limfatycznych różnią się nieregularnym zarysem i brakiem ośrodków rozmnażania!

• migdałki → grudki limfatyczne ułożone pojedynczo lub w skupiskach w miejscu krzyżowania się górnych dróg oddechowych z przewodem pokarmowym; pokryte są nabłonkiem wielowarstwowym płaskim (niektóre nabłonkiem wielorzędowym walcowatym), który wnika w głąb tkanki limfatycznej tworząc krypty; wyróżniamy migdałek językowy, gardłowy, nagłośniowy, podniebienne, trąbkowe i krtaniowe

• tkanka limfatyczna związana z przewodem pokarmowym → w blaszce właściwej błony śluzowej jak i sródnabłonkowo występują rozproszone limfocyty, ponadto między komórkami nablonka występują grudki, pokryte nabłonkiem o większej ilości limfocytów (szczególnie T_h), brak jest natomiast kosmków i krypt jelitowych a obecne są komórki M, uczestniczące w transporcie antygenów; wyróżniamy:

• grudki limfatyczne samotne → zlokalizowane w blaszce wlaściwej błony śluzowej, szczególnie częste w końcowym odcinku jelita cienkiego

• grudki limfatyczne skupione (kępki Peyera) → występują przede wszystkim w jelicie krętym, szczególnie w koncowym odcinku; wyróżniaja się dużą ilością limfocytów T_s i proliferacją limfocytów B bez przekształcania się w plazmocyty; w grudkach znajdują się żyłki pozawłosowate wysłane tzw. wysokim środbłonkiem (miejsce przechodzenia limfocytów z krążenia do grudek)

• grudki limfatyczne wyrostka robaczkowego → w blaszce wlaściwej

• Węzły limfatyczne → pobudzane przez antygeny limfy

• otoczone torebką łącznotkankową od ktorej odchodzą łącznotkankowe beleczki promieniste (beleczki kory, o regularnym przebiegu, dzielące korę na nisze/komory), przechodzące głębiej w beleczki rdzenne (o przebiegu nieregularnym, rozgałęzionym)

• pod torebką znajduje się zatoka brzeżna do której od strony wypukłej węzła uchodzą naczynia limfatyczne; następnie limfa płynie przez zatoki promieniste i zatoki rdzenne uchodząc we wnece do naczyń odprowadzających; w świetle zatok widoczne są biegnące w poprzek włókna siateczkowe i kolagenowe oraz wolne makrofagi i limfocyty; trzy pierwsze stanowią swoisty filtr dla przepływajacej limfy

• miąższ węzła odgraniczony jest od zatok barierą ułożona z fibroblastów; tkanka wypełniajaca nisze przechodzi w tzw. pasma zagęszczania, następnie w sznury rdzenne

• w budowie wyróżniamy:

• zrąb → rusztowaniem jest torebka łącznotkankowa i beleczki; utworzony jest przez sieć włókien (głównie siateczkowych) i komórek dendrytycznych (zdolnych do długotrwałego przechowywania antygenu); w okach sieci leżą limfocyty

• kora

• kora zewnętrzna → obejmuje nisze wypełnione tkanką limfatyczną z gęsto ułożonymi limfocytami; gdy węzeł uczestniczy w odpowiedzi immunologiczenj, w niszach pojawiają się grudki limfatyczne, w których wyróżniamy:

• osrodek rozmnażania → pojawiają się w kilka dni po stymulacji antygenem

• strefa ciemna - centroblasty (proliferujace limfocyty B), makrofagi uczestniczące w ich fagocytozie, nieliczne limfocyty T i wypustki komórek dendrytycznych

• strefa jasna podstawna - nieliczne centroblasty, makrofagi, duże centrocyty, komórki dendrytyczne grudek i niewielka ilość limfocytów T

• strefa jasną szczytowa - małe centrocyty, liczne limfocyty T, wypustki komórek dendrytycznych grudek

• strefa zewnętrzna - płaszcz limfocytów T

• pasmo zagęszczania (plaszcz grudki) → uciśnięta przez rozrastajacy się osrodek rozmnażania część węzła limfatycznego

• strefa przykorowa → obszar grasiczozależny utworzony przez korę pośrednią i korę głęboką, w którym przeważają limfocyty T

• rdzeń → składa się z beleczek, zatok i sznurów rdzennych; w węzłach pobudzonych do odpowiedzi immunologicznej w sznurach rdzennych obserwuje się komórki plazmatyczne (sznury są więc miejscem wytwarzania przeciwciał)

• Śledziona → pobudzana przez antygeny krwi (te które dostały się bezpośrednio, i te, występujące w dużych ilościach w limfie, i nie zatrzymane w węzłach dotarły się do krwi w małym stężeniu)

• otoczona torebką łącznotkankową od której odchodzą beleczki łącznotkankowe zbudowane z tkanki łącznej wlóknistej; stanowia one rusztowanie dla zrębu zbudowanego z sieci wlókien siateczkowych oraz komórek: makrofagow i komórek dendrytycznych

• unaczynienie

• odgałęzienia tętnicy sledizonowej biegna w beleczkach

• tętnice pozabeleczkowe (~0,2mm) otoczone są pochewką z limfocytów i włókien siateczkowych, do której miejscami przylegają grudki limfatyczne

• tętnice środkowe unaczyniają włośniczkami grudki a opuszczając je dzielą się promieniście

• tętniczki pedzelkowate dziela się na 2-3 tętniczki otoczone pochewka limfatyczną (Schweiggera-Seidela), z koncentrycznie ułozonymi makrofagami

• po wyjsciu z pochewki tętniczka dzieli się w naczynia włosowate skąd krew wpływa do zatok śledzionowych, potem do żyl miazgowych → beleczkowych → śledzionowych

• miąższ śledziony dzielimy na:

• miazgę białą - obejmuje pochewki limfatyczne wokół tętnic pozabeleczkowych (zawierające glownie limfocyty T → obszar grasiczozależny) oraz grudki limfatyczne

• strefę brzeżną - obszar otaczający pochewki i grudki

• miazgę czerwoną - zawiera erytrocyty i krwinki jądrzaste

• miazga czerwona właściwa - zawiera dużo makrofagów, wypustkami wpuklającymi się do światla zatok; w okresie płodowym zawiera też wszystkie komórki krwiotwórcze, a u osób doroslych tylko prekursory limfocytów i monocytów

• zatoki żylne

• Naczynia limfatyczne - limfatyczne naczynia wlosowate różnia się od krwionośnych tym, że brakuje im dobrze rozwiniętej błony podstawnej oraz zaczynaja się ślepo w tkance łącznej

Przeciwciała

Teoria selekcji klonów komórkowych jest hipotezą tłumaczącą powstawanie przeciwciał. Zakłada ona występowanie w organizmie bardzo dużej liczby klonów limfocytów gotowych do odpowiedzi na wiele różnych antygenów jeszcze przed ich wtargnięciem do ustroju. Jeżeli określony antygen dostanie się do organizmu to jest on rozpoznawany przez określony klon limfocytów.

Geny immunoglobulinowe:

• część zmienna łańcucha lekkiego jest kodowana przez 2 segmenty genowe: V i J

• dla łańcucha kappa na 2 chromosomie

• dla łańcucha lambda na 22 chromosomie

• część zmienna łańcucha ciężkiego jest kodowana przez 3 segmenty genowe: V, D i J znajdujące się na chromosomie 14 (część też na chromosomie 15 i 16 ale geny te nie biorą udziału w syntezie przeciwciał)

• część stałą koduje gen C

Źródła zmienności przeciwciał:

1. Zmienność kombinacyjna- związana jest z faktem iż istnieje wiele wariantów genów V, D i J w genomie, stąd ich przypadkowe łączenie się w drodze wielokrotnej rekombinacji zwiększa ilość możliwości powstałych części zmiennych. Rekombinacja zachodzi dzięki enzymowi- rekombinazie (która rozpoznaje sekwencje sygnałowe) najczęściej na drodze wypętlenia i delecji, prowadząc w efekcie do powstania kolistego DNA. Rolę w rekombinacji odgrywają:

• produkty genów RAG1 i RAG2 o aktywności endonukleaz (powodują pojawianie się nacięć w niciach DNA)

• białka biorące udział w naprawie uszkodzeń DNA

• niezbędne jest rozluźnienie struktury chromatyny w miejscach rekombinacji

• obecność niektórych czynników transkrypcyjnych

Zmienność na złączach- w czasie formowania się złącza sygnałowego (łączenie sekwencji sygnałowych prowadzące do powstania kulistego DNA) dochodzi do:

• delecji (czyli usunięcia) pewnej liczby nukleotydów

• wstawienia (insercji) nowych nukleotydów:

• powstanie regionów N- nowe odcinki DNA powstające bezmatrycowo dzięki aktywności transferazy nukleotydów terminalnych

• nukleotydy P powstają w skutek dołączenia 1-2 komplementarnych nukleotydów do ostatnich nukleotydów złącza

• chwytanie oligonukleotydów to przyłączanie do złącza oligonukleotydów (5-7 zasad) odciętych w innym miejscu w procesie rekombinacji

• Redagowanie receptora zachodzi podczas dojrzewania limfocytu B w szpiku, który z dużym powinowactwem rozpoznaje jakiś autoantygen swoimi receptorami BCR i polega na ponownej rekombinacji genów immunoglobulinowych (dzięki temu zmianie ulega swoistość receptora, który traci zdolność do wiązania autoantygenu)

• Ponowne redagowanie receptora polega na rearanżacji genów immunoglobulinowych limfocytu B w celu odzyskania zdolności wiązania antygenu, którą uprzednio utracił (lub uległa zmniejszeniu) w skutek mutacji

• Mutacje somatyczne zachodzące w genach w czasie stymulowanej przez antygen proliferacji i różnicowania limfocytów B w komórki pamięci (czyli nie zachodzi w limfocytach dziewiczych ale dopiero po kontakcie z antygenem). Są to najczęściej mutacje punktowe indukowane przez enzym AID i polega najczęściej na zmianie pojedynczego aminokwasu w części zmiennej łańcucha ciężkiego lub lekkiego.

Dzięki mutacjom zachodzi tzw. dojrzewanie odpowiedzi immunologicznej (dojrzewanie powinowactwa) polegające na wzroście powinowactwa przeciwciał do antygenu. Umożliwiają one „dogonienie” mutujących mikroorganizmów, którego antygeny mogą się zmieniać. Ryzykiem jest jednak możliwość powstania przeciwciał rozpoznających antygeny własne, co może prowadzić do autoagresji.

Regulacja ekspresji genów immunoglobulinowych zależy od sekwencji regulatorowych, do których należą: promotory, wzmacniacze (indukujące syntezę immunoglobulin) i wyciszacze (hamujące transkrypcje z określonych promotorów).

Pierwsze immunoglobuliny wytwarzane przez limfocyty B należą do klasy IgM i są uwalnianie w postaci rozpuszczalnej lub jako receptory immunoglobulinowe. Następnie limfocyt uwalnia przeciwciała klasy IgD. Zmiana klas syntetyzowanych przeciwciał zachodzi dopiero po rozpoznaniu przez limfocyt B swoistego antygenu. W procesie tym niezbędna jest pomoc limfocytów Th:

limfocyt B limfocyt T

CD40 CD154 (CD40L)

B7 CD28

W wyniku kontaktu poprzez parę cząstek CD40-CD154 oraz cytokiny (IL-4) limfocyt B uzyskuje bodziec do zmiany klasy (na drodze ponownej rekombinacji genów immunoglobulinowych). Może ona być:

• jednorazowa, np. na IgG, IgE lub IgA

• dwuetapowa, czyli z IgM na IgG, a dopiero potem na IgE lub IgA

---