Ćwiczenie IV
Metody hodowania bakterii.
Przed rozpoczęciem pracy należy dokładnie przeczytać instrukcję. Pracujemy w parach.
Omówienie wyników poprzedniego ćwiczenia.
Hodowla Escherichia coli na podłożu płynnym.
Doświadczenie to ma na celu określenie liczby bakterii metodą spektrofotometryczną i seryjnych rozcieńczeń
w hodowli stacjonarnej E. coli w poszczególnych fazach jej wzrostu. W tym celu należy zaszczepić 50 ml jałowego bulionu
1.5 ml hodowli nocnej Escherichia coli. Hodowlę bakterii inkubować w wytrząsarce powietrznej w temperaturze 37oC. Co pół godziny kolejna para pobiera 2 ml hodowli w celu wykonania pomiaru absorbcji w spektrofotometrze i określenia miana bakterii (liczba bakterii w 1 ml hodowli) w pobranej próbce metodą seryjnych rozcieńczeń.
Pośrednie określanie liczby bakterii metodą spektrofotometryczną.
Metoda ta wykorzystuje istnienie zależności pomiędzy gęstością optyczną hodowli bakteryjnej a jej mianem.
W metodzie tej mierzy się zmętnienia hodowli bakteryjnej przy pomocy spektrofotometru. W tym celu należy
do kuwety wlać 1 ml badanej hodowli bakteryjnej, umieścić kuwetę w spektrofotometrze i odczytać wartość gęstości optycznej (absorbancji) próbki przy długości fali 600 nm. Jako kontroli należy użyć jałowej pożywki. Na podstawie wykonanych pomiarów wykreślić krzywą (na papierze milimetrowym) obrazującą zmianę gęstości optycznej hodowli
w czasie.
Bezpośrednie określanie liczby bakterii metodą seryjnych rozcieńczeń.
Do 6 jałowych probówek rozlać po 0.9 ml jałowego roztworu soli fizjologicznej (0.85% NaCl). Do pierwszej probówki dodać 0.1 ml hodowli bakteryjnej (-> 1 ml; zawiesina bakteryjna rozcieńczona 10 razy; 10-1), całość dobrze wymieszać. Następnie do drugiej probówki przenieść 0.1 ml zawartości pierwszej probówki (rozcieńczenie 100 razy; 10-2) i dokładnie zamieszać. Analogicznie wykonać pozostałe rozcieńczenia (10-3, 10-4, 10-5, 10-6). Z trzech ostatnich rozcieńczeń - 10-4, 10-5
i 10-6 pobrać po 0.1 ml zawiesiny bakteryjnej, a następnie dokładnie rozprowadzić jałową głaszczką po powierzchni płytek
z agarem wzbogaconym (do każdego posiewu użyć osobnej płytki). Płytki inkubować 24 godziny w temperaturze 37ºC.
Na następnych zajęciach należy policzyć kolonie, które wyrosły na płytkach. Zakładając, że pojedyncza kolonia powstaje
z jednej komórki bakteryjnej, można określić liczbę żywych komórek obecnych w 1 ml badanej hodowli (miano bakterii) posługując się następującym wzorem:
n
N =
R × V
gdzie:
N - oznacza miano hodowli bakteryjnej (liczba bakterii w 1 ml)
n - liczbę kolonii, które wyrosły na płytce przy danym rozcieńczeniu
R - rozcieńczenie
V - objętość próby
Na podstawie uzyskanych wyników obliczyć miano bakterii w poszczególnych fazach wzrostu hodowli.
Jedna para określi miano bakterii mlekowych w jogurcie Aktimel. Seryjne rozcieńczenia bakterii należy wykonać
w sposób identyczny jak dla E. coli. Końcowe rozcieńczenia należy wysiać na płytki agarowe z podłożem HIAS.
Metody hodowania bakterii beztlenowych.
Odtlenianie biologiczne metodą Fortnera - DEMONSTRACJA - jedna płytka na grupę.
Płytkę z podłożem agarowym podzielić na dwie części przez narysowanie na spodzie szalki kreski. Na jednej części posiać bakterie, które są bezwzględnymi tlenowcami (Serratia marcescens) a na drugiej bakterie beztlenowe (Clostridium sp.). Następnie płytkę Petriego przykryć odwróconą przykrywką i zakleić szczelnie parafilmem.Inkubować przez 24 godziny
w temperaturze 37oC. Jako pierwsze wyrastają bakterie tlenowe, które w miarę wzrostu zużywają dostępny tlen przygotowując tym samym warunki do rozwoju bakterii beztlenowych.
Odtlenianie metodą chemiczną - DEMONSTRACJA - jedna płytka na grupę.
Na płytkę z podłożem agarowym posiać bakterie beztlenowe (Clostridium sp.). Z bibuły przygotować małą kopertę, którą następnie napełnić mieszaniną odtleniającą (0.5 g pyrogallolu, 0.25 g węglanu potasu, 1 g ziemi okrzemkowej) i przykleić
do pokrywki płytki Petriego. Następnie płytkę Petriego przykryć odwróconą przykrywką i zakleić szczelnie parafilmem. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37oC. Mieszanina zredukowanych związków chemicznych pochłania tlen umożliwiając rozwój bakterii beztlenowych.
Odtlenianie z użyciem świecy - DEMONSTRACJA - jedna płytka na grupę.
Na płytkę z podłożem agarowym posiać bakterie beztlenowe (Clostridium sp.). Płytkę umieścić w eksykatorze. Wstawić
do niego płonącą świeczkę. Zamknąć eksykator. Po wypaleniu się świecy umieścić eksykator w cieplarce (37oC).
Hodowla w próżni z wykorzystaniem anaerostatu - 2 pary przygotowują po jednej płytce z wybraną bakterią.
Na płytkę z podłożem agarowym posiać bakterie beztlenowe (Clostridium sp.). Jako kontrolę zastosować płytkę
z posianym szczepem bakterii tlenowej (Serratia marcescens). Obie płytki umieścić w anaerostacie i przy pomocy pompki wodnej usunąć z niego powietrze. Anaerostat z płytkami inkubować 24 godziny w temperaturze 37oC.
Hodowla na podłożu płynnym z tioglikolanem sodu.
Usunąć tlen z podłoża poprzez zagotowanie i szybkie oziębienie pożywki. Posiać bakterie beztlenowe (Clostridium sp.), powierzchnię pożywki przykryć cienką warstwą parafiny (w celu utrudnienia dostępu powietrza) i zamknąć gumowym korkiem. Probówki inkubować 24 godziny w temperaturze 37oC. Tioglikolan sodu jest związkiem zredukowanym, który utleniając się zużywa tlen obecny w podłożu umożliwiając rozwój bakterii beztlenowych. Obecna w pożywce rezazuryna
w formie utlenionej ma barwę różową. Zredukowana rezazuryna (warunki beztlenowe) jest bezbarwna. Niewielki dodatek agaru w podłożu (0.75 g/litr) utrudnia dyfuzję tlenu z otoczenia.
Posiew wymazu z gardła na podłoża diagnostyczne (Chapmana, krwawe, MacConkey'a)
- komplet 3 płytek na parę.
Podłoże Chapmana służy do izolacji i różnicowania szczepów gronkowcowych. Czynnikiem wybiórczym jest wysokie stężenie NaCl (7,5%) natomiast czynnikiem różnicującym jest mannitol. Szczepy rozkładające mannitol zmieniają zabarwienie podłoża z różowego (czerwień fenolowa) na żółty. Szczepy nie mające zdolności do rozkładu mannitolu nie zmieniają zabarwienia podłoża
Podłoże krwawe służy do izolacji paciorkowców oraz do określenia zdolności bakterii do hemolizy erytrocytów.
Na podłożu agarowym z krwią bakterie te mogą być otoczone strefą hemolizy beta, alfa lub gamma. Bakterie zdolne
do hemolizy beta powodują całkowite rozpuszczenie krwinek, w efekcie powstaje wyraźnie odgraniczona
od niezhemolizowanego podłoża przejrzysta strefa. Bakterie zdolne do hemolizy alfa częściowo rozpuszczają krwinki powodując zazielenienie otaczającego je podłoża. Strefa hemolizy alfa charakteryzuje się niewielką przejrzystością. Bakterie nie wykazujące właściwości hemolitycznych określa się jako przeprowadzające hemolizę gamma.
Podłoże MacConkey'a służy do izolacji pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae. W skład podłoża MacConkey'a oprócz składników podstawowych wchodzi czynnik różnicujący, którym jest laktoza oraz czynnik wybiórczy - fiolet krystaliczny. Pałeczki rozkładające laktozę tworzą kolonie o barwie czerwonej (czerwień obojętna) natomiast pałeczki, nie fermentujące laktozy tworzą kolonie o barwie różowej.
Test na obecność bakterii w produktach spożywczych.
Na jałowej płytce z podłożem agarowym zrobić odcisk ukrojonego plastra wędliny. Płytkę inkubować w temperaturze pokojowej przez kilka dni.
Przypominamy o obowiązku umycia rąk na zakończenie ćwiczeń.
Wyszukiwarka