Wykrywanie cukrów:

PRÓBA MOLISCHA - Jeśli na granicy roztworu i stężonego H₂SO₄ powstaje pierścień barwy czerwonofioletowej to znaczy że w roztworze znajduję się cukier lub cukry.

PRÓBA Z ANTRONEM - Jeśli po zmieszaniu roztworu z odczynnikiem antronowym powstanie zielony lub niebieski kolor znaczy to że w roztworze znajduje się cukier lub cukry.

PRÓBA SELWINOWA Z REZORCYNĄ (DO WYKRYWANIA KETOZ) - Pod wpływem kwasu solnego ketozy (lub wielocukry na które składają się ketozy) o wiele łatwiej przechodzą w hydroksymetylofurfural niż aldozy. Po dłuższym niż 30 sek gotowaniu próby - zabarwienie pojawi się również w roztworze w którym są aldozy.

PRÓBA BIALA Z ORCYNĄ (DO WYKRYWANIA PENTOZ) -Po wpływem ogrzewania z kwasem pentozy przechodzą w furfural, który w obecności soli żelazowych oraz orcyny daje charakterystyczne zielone zabarwienie

PRÓBA BERFOEDA (ODRÓŻNIANIE JEDNOCUKRÓW OD DWUCUKRÓW) - Wykorzystuje ona obniżenie zdolności redukcyjnych cukrów w środowisku kwaśnym. Przy krótkim czasie ogrzewania, kwaśnym środowisku i niskim stężeniu cukru otrzymujemy wynik dodatni (czerwony osad) dla cukru prostego a ujemny dla dwucukrów redukujących.

PRÓBA JODOWA (WYKRYWANIE SKROBII) - W środowisku alkaicznym jod cząsteczkowy wchodzi w reakcję i powstaje jodek (a w związku z tym ciemnoniebieskie zabarwienie, które znika po oziębieniu próby). W obecności skrobi zabarwienie nie wystąpi.

STOPNIOWA KWAŚNA HYDROLIZA - w początkowej fazie hydrolizy powstają amylodekstryny, dające fioletowe zabarwienie z jodem. Dalsze produkty rozpadu to erytrodekstryny dające z jodem barwę czerwoną, a następnie achrodekstryny i maltodekstryny nie dające z jodem zabarwienia. W końcowej fazie rozpadu powstaje maltoza oraz wolne cząsteczki glukozy.

OZNACZANIE PEROKSYDAZY W SOKU ZIEMNIACZANYM -

benzydyna + H₂O₂ + sok ziemniaczany dwufenohinonodwuimil; kondensuje on z cząsteczką benzydyny tworząc zielono-niebieskie zabarwienie, zwane błękitem benzydynowym

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI KATALAZY WE KRWI -

woda destylowana + krew + H₂O₂ O₂ i tworzy się obfita piana.

2H₂O₂ +enzym (katalaza) 2 H₂O + O₂

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI OKSYDAZY ALDEHYDOWEJ W MLEKU - oksydaza aldehydowa utlenia aldehydy przenosząc wodory na tlen atmosferyczny. Powstaje wówczas woda utleniona.

mleko świeże + woda destylowana + aldehyd mrówkowy + błękit metylenowy (pokrywamy płynną parafiną). Łącząc się z wodorem błękit metylenowy odbarwia się, barwa niebieska osłabia się lub całkowicie zanika.

Metabolizm węglowadanów:

OZNACZANIE POZIOMU GLUKOZY WE KRWI METODĄ KOLORYMETRYCZNĄ HULTMANA - w środowisku kwasu octowego lodowatego aldozy tworzą połączenia barwne z aminami aromatycznymi, np. z o-toluidyną.

Glukoza + TCA + o-toluidyna barwa zielona

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI AMLOLITYCZNEJ AMYLAZY (lub WYKRYWANIE AMYLAZY W ŚLINIE) - oparte jest na istnieniu zależności między ilością skrobi a natężeniem barwy niebieskiej jaką daje ona z jodem. Na skutek działania amylazy zmniejsza się zawartość cząsteczek skrobi w roztworze, a tym samym natężenia zabarwienia, co mierzymy za pomocą fotokolorymetru.

Badanie właściwości glikogenu:

- PRÓBA JODOWA - do glikogenu dodajemy kroplę roztworu J w KJ. Pojawia się zabarwienie czerwono-brunatne.

- STOPNIOWA KWAŚNA HYDROLIZA GLIKOGENU - podczas kwaśnej hydrolizy glikogenu obserwujemy:

- barwliwość z jodem

- właściwości redukcyjne pośrednich produktów hydrolizy

- HYDROLIZA ENZYMATYCZNA SKROBI - cząsteczki skrobi ulegają hydrolizie enzymatycznej pod wpływem amylazy. Amylaza ślinowa jest enzymem należącym do klasy hydrolaz, występującym obficie w ślinie, powoduje hydrolityczny rozkład wiązań C1-C4

- kleik skrobiowy + ślina + 10minut łaźnia wodna (38°c) + J w KJ - obserwujemy zabarwienie

- kleik skrobiowy + ślina + 10minut łaźnia wodna (38°c) + J w KJ + odczynnik Benedicta - zależnie od zawartości cukru w roztworze powstaje zielone zabarwienie lub wytrąca się osad barwy żółtej, pomarańczowej lub czerwonej.

Metabolizm lipidów

Kwasy żółciowe:

PRÓBA PETTENKOFERA (WYKRYWANIE KWASÓW ŻÓŁCIOWYCH) - Do roztworu żółci dodajemy kryształy sacharozy. Podwarstwiamy stężonym H₂ SO₄ . na granicy płynów powstaje purpurowy pierścień ze względu na występowanie grup OH w kwasach!

PRÓBA HAYA (WYKRYWANIE KWASOW ŻÓŁCIOWYCH):

do probówki wlewamy roztwór żółci, jednocześnie do drugiej probówki dajemy taką sama ilość wody destylowanej. Na powierzchnie płynów wsypujemy odrobinę kwiatu siarczanowego. W roztworze żółci opada deszcz siarkowy, natomiast w próbie z wodą siarka zatrzymuje się na powierzchni. Przyczyną zatrzymania siarki na powierzchni wody jest jej wysokie napięcie powierzchniowe, które w obecności kw. Żółciowych zostaje obniżone.

WYKRYWANIE EMULGUJĄCEGO DZIAŁANIA ŻÓŁCI:

Do roztworu mydła dodajemy stężonego H₂SO₄ w celu wydzielenia wolnych kwasów tłuszczowych, które po energicznym wstrząśnięciu i odstawieniu próby gromadzą się na powierzchni płynu. Do próby wlewamy roztwór żółci i wstrząsamy. Obserwujemy rozpuszczenie się kwasów tłuszczowych

PRÓBA SALKOWAKIEGO (WYKRYWANIE CHOLESTEROLU):

Warunkiem tej próby jest zachowanie środowiska bezwodnego. Pod wpływem H₂ SO₄ następuje odłączenie 2 cząsteczek wody i połączenie 2 cząsteczek cholesterolu przy węglach C₃ w bicholestadien. Jednocześnie przy węglach C₇ następuje dołączenie 2 reszt sulfonowych. Powstaje kwas 2- sulfonowy o czerwonym zabarwieniu.

PRÓBA LIBERMANA - BURCHARDA (WYKRYWANIE CHOLESTEROLU):

Pod wpływem stężonego H₂SO₄ i bezwodnika kwasu octowego powstaje kwas jedno-sulfonowy, który w pierwszej fazie ma kolor czerwony, a następnie zmienia barwę na zieloną.

OZNACZANIE LIPIDÓW CAŁKOWITYCH W SUROWICY METODĄ SULFOWANILINOWĄ:

Przygotowujemy dwie probówki. W jednej przygotowujemy próbę badaną, w drugiej wzorcową. Do obydwu dodajemy stęż. kwasu siarkowego. Dokładnie mieszamy i wstawiamy do łaźni wrzącej. Do prob. K odmierzamy stęż. H₂SO₄ . do wszystkich prob. dodajemy odczynnika wanilinofosforowego, a następnie zawartość każdej prob. mieszamy dokładnie oddzielną bagietką. Powstałe różowe zabarwienie próby badanej i wzorcowej kalorymetrujemy przy 530 nm. wobec próby K. Wyniki podstawiamy do wzoru

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI LIPAZY W SOKU TRZUSTKOWYM:

Najczęściej stosowanym substratem do oznaczania aktywności lipazy trzustkowej w soku trzustkowym jest oliwa z oliwek.

Przebieg oznaczenia: dwie małe kolbki oznaczamy jako próbę badaną i próbę kontrolną, i odmierzamy do nich równa ilość soku trzustkowego. Próbę kontrolna umieszczamy we wrzącej łaźni wodnej w celu inaktywacji enzymu. Do obydwu prób odmierzamy bufor fosforanowy, oraz emulsję oliwy. Próby umieszczamy w łaźni. Po zakończeniu inkubacji próby wyjmujemy z łaźni wodnej odmierzamy do nich etanol i fenoloftaleinę. Obydwie próby miareczkujemy roztworem NaOH do barwy jasno różowej.

Obliczenie:

Od liczby cm³ rozt. NaOH zużytego do miareczkowania próby odejmujemy wartość dla próby K i mnożymy przez 1250 w celu przeliczenia na mikromol produktu. Wynik otrzymujemy w IU aktywności enzymu. IU = (B-K) ● 1250

Metabolizm białek i aminokwasów

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI PROTEOLITYCZNEJ TREŚCI ŻOŁĄDKA I DWUNASTNICY:

- substrat: zawiesina z gotowanego białka jaja kurzego i wody (1:5)

- wprowadzamy treść żołądkową zwykłą i zagotowaną, wodę destylowaną, HCl, Na₂CO₃, treść dwunastniczą zwykłą i zagotowaną, zawiesinę białka

- obserwujemy proces trawienia białka na podstawie zaniku zmętnienia zawiesiny białka, który zachodzi dzięki enzymom proteolitycznym (powodują hydrolizę białek, np. pepsyna, trypsyna)

WYKRYWANIE MOCZNIKA:

PRÓBA Z PODBROMIANEM SODOWYM:

roztwór mocznika + podbromian sodu „burzenie roztworu” na skutek intensywnego wydzielania gazu

Następuje rozkład mocznika na azot, CO₂, H₂O

CO₂ wiąże się z NaOH w węglan sodowy

ROZKŁAD MOCZNIAKA ZA POMOCĄ UREAZY:

roztwór mocznika + ureaza po podgrzaniu i przystawieniu papierka lakmusowego - zniebieszczenie pod wpływem wydzielania amoniaku

REAKCJA PIOTROWSKIEGO ( PRÓBA BIURETOWA):

kryształki mocznika ogrzanie wydziela się amoniak

pozostała biała substancja = biuret

biuret + H₂O destylowana + NaOH + Cu SO₄ barwa fioletowa

Biuret ma wiązania peptydowe charakteryzujące peptydy i białka. Powstanie fioletowej barwy związane jest z utworzeniem soli kompleksowej na skutek koordynacyjnego połączenia miedzi z dwoma przyległymi wiązaniami peptydowymi.

ILOŚCIOWE OZNACZNIE MOCZNIKA W SUROWICY METODĄ YATZIDISA:

Próba oparta na reakcji barwnej jaką daje mocznik z odczynnikiem Ehrlicha. Wykonujemy próby 0-5, B, K, kalorymetrujemy i wykreślamy krzywą wzorcową.

W surowicy znajduje się od 3,33-6,66 mmol mocznika w 1 dm³. rośnie z wiekiem, w chorobach nerek. Obniża się przy uszkodzeniach wątroby. Organizm wydala ok. 0,3 mole mocznika na dm³.

Wkrywanie kreatyniny:

PRÓBA WEYLA - roztwór kreatyniny + nitroprusydek sodowy + NaOH czerwone zabarwienie, po pewnym czasie blednie, po dodaniu kw. octowego zanika zupełnie

PRÓBA JAFFEGO: roztwór kreatyniny +H₂O destylowana + kw. pikrynowy nasycony pomarańczowo-czerwone zabarwienie pikraminianu sodu

Metabolizm porfiryn

PRÓBA PSEUDOPEROKSYDAZOWA HEMOGLOBINY (TEST NA WYKRYWANIE ŚLADOWYCH ILOŚCI HEMOGLOBINY)

H₂O dest + krew + benzydyna + H₂O₂ niebieskie zabarwienie.

Reakcja nie jest związana z enzymami ponieważ zagotowanie roztworu nie wpływa na wynik próby. Odczyn barwny z benzydyną daje układ hemowy hemoglobiny - żelazo

WYKRYWANIE BILIRUBINY W SUROWICY KRWI - ODCZYN VAN DEN BERGA

- odczyn bezpośredni - surowica + odczynnik dwufazowy

jest dodatni jeśli w ciągu 30 sekund pojawi się czerwone lub fioletowe zabarwienie

- odczyn pośredni - surowica + etanol (po odwirowaniu dodajemy odczynnik 1 i 2)

pojawia się różowo-fioletowe zabarwienie

W warunkach prawidłowych surowica nie daje dodatniego odczynu bezpośredniego, a słaby pośredni. W surowicy do 17,1 μmol/dm³ bilirubiny

WYKRYWANIE UROBILINOGENU W MOCZU:

mocz + odczynnik Ehrlicha czerwone zabarwienie

Urobilinogen w wysokich stężenniach HCl kondensuje z aldehydowym odczynnikiem Ehrlicha na intensywnie czerwony barwnik

ILOŚCIOWE OZNACZANIE HEMOGLOBINY METODĄ DRABKINA:

Pod wpływem odczynnika Drabkina, który zawiera sześciocyjanożelazian potasu oraz cyjanek potasu w buforze węglanowym. Następuje przekształcenie Hb w cyjanomethemoglobinę o barwie karminowej

OTRZYMYWANIE ROZTWORU HEMOGLOBINY I OKSYHEMOGLOBINY:

Roztwór hemoglobiny i oksyhemoglobiny + H₂O dest. hemolizant krwi, który dzielimy na dwie części

• wstrząsamy z powietrzem barwa jasnoczerwona na skutek łączenia się Hb z tlenem z powietrza (Hb-O₂)

dodajemy (NH₄)₂S - następuje odtlenowanie Hb (barwa ciemniejsza ) wstrząśnięcie - (barwa jaśniejsza) - ponowne utlenowanie

---