0 Cwiczenie 1 II rok spraw, biotechnologia inż, sem3, BKiIG, laborki, sprawka


Ćwiczenie 1

Izolacja jąder komórkowych i ekstraktów jądrowych

Przygotowanie teoretyczne:

A. Materiały:

zamrożone komórki z hodowli

PBS (phosphate buffered saline - sól fizjologiczna w buforze fosforanowym):

13.7 mM NaCl

0.27 mM KCl

0.43 mM Na2HPO4

0.14 mM KH2PO4

wirówka stołowa wychłodzona w witrynie/wirówka z chłodzeniem

bufor do izolacji EC (ekstraktu cytoplazmatycznego)

20 mM Tris:HCl pH 7.6 (bufor)

10 mM KCl

2 mM MgCl2

1 mM ditiotreitol [DTT] (substancja redukująca)

0.5 mM EDTA (chelator jonów II-wartościowych)

0.5% NP40 (niejonowy detergent)

2.5% glicerol (substancja zagęszczająca)

Mieszanina inhibitorów proteaz (hamują działanie enzymów proteolitycznych)

bufor niskosolny (0.02 M NaCl) (low)

20 mM Hepes pH 7.9

25% glicerol

1.5 mM MgCl2

0.02 M NaCl

0.2 mM EDTA

Mieszanina inhibitorów proteaz

bufor wysokosolny I (0.8 M NaCl) (high 0.4)

20 mM Hepes pH 7.9

25% glicerol

1.5 mM MgCl2

0.8 M NaCl

0.2 mM EDTA

Mieszanina inhibitorów proteaz

wytrząsarka

mikroskop optyczny, szkiełka podstawowe i nakrywkowe

0.4% fiolet krystaliczny do barwienia komórek

B. Wykonanie:

Wszystkie czynności należy wykonywać w lodzie, lub szafie chłodniczej

Wszystkie probówki należy dokładnie opisywać wpisując grupę, sekcję, datę i nazwę preparatu!

Probówki należy opisywać przed dodaniem preparatu

Preparaty wyizolowane na ćwiczeniach będą potrzebne do następnych zajęć!

  1. Zamrożone komórki rozmrozić w lodzie, zawiesić w 500 μl PBS 1x, zmierzyć objętość (potrzebna do obliczenia objętości komórek), zanotować. Obliczyć objętość samych komórek.

  2. Odpipetować 10 μl do osobnej probówki (podpisać „komórki”), resztę odwirować
    10 minut, 180-186xg (RCF).

  3. Ściągnąć i odrzucić supernatant, osad komórek zawiesić w 5-krotnej objętości buforu
    do izolacji EC. Probówkę inkubować 10 minut w lodzie kilkakrotnie mieszając.

  4. Po inkubacji komórki lekko wytrząsnąć i odwirować 10 minut, 300-321xg (RCF).

  5. Zebrać supernatant do osobnej probówki (podpisać: EC = ekstrakt cytoplazmatyczny).

  6. Osad zawiesić w trzech objętościach buforu niskosolnego (po konsultacji z prowadzącym ćwiczenia).

  7. Ostrożnie zmierzyć objętość, odpipetować 10 μl zawiesiny do osobnej probówki (podpisać „jądra”).

  8. Do reszty dodać równą objętość buforu wysokosolnego „high 0.8”

  9. Mieszaninę wytrząsać 30 minut w 40C, a następnie odwirować na maksymalnych obrotach przez 30 minut.

  10. W czasie inkubacji odpipetowane wcześniej komórki i jądra obejrzeć pod mikroskopem (kroplę zawiesiny nanieść na szkiełko podstawowe, dodać barwnika [fiolet krystaliczny], nakryć ostrożnie szkiełkiem nakrywkowym). Obrazy narysować w dzienniku laboratoryjnym.

  11. Po zakończonym wirowaniu wyjąć probówki, delikatnie ściągnąć supernatant i przenieść do nowej probówki (podpisać: EJ 0.4 M = ekstrakt jądrowy). Zmierzyć i zapisać objętości preparatów.

  12. Przygotować 2 probówki, do każdej z nich odpipetować po 798 l H2O. Odpipetować po 2 l ekstraktów białkowych: do probówki 1 - EC, do probówki 2 - EJ 0.4 M. Dodać po 200 l odczynnika Bradforda, wymieszać, po ok. 5 minutach zmierzyć stężenie białek przy użyciu spektrofotometru (próba ślepa: H2O + odczynnik Bradforda, jedna na grupę).

  13. Do obliczeń stężenia białka skorzystać ze wzoru:

C [μg/μl] = A595 x b : c

gdzie b jest współczynnikiem wyznaczanym z krzywej wzorcowej i wynosi 16.2,
a c jest ilością białka pobranego do pomiaru (tu: 2 μl)

  1. Preparaty - ekstrakty cytoplazmatyczne i jądrowe zamrozić w suchym lodzie i przenieść do zamrażarki.

W sprawozdaniu należy umieścić:

  1. Krótki opis procedury, z uwzględnieniem mierzonych objętości komórek i preparatów.

  2. W wynikach:

    1. Rysunki preparatów komórkowych i jąder. Należy zwrócić uwagę, czy udało się wyizolować jądra komórkowe.

    2. Wyniki pomiaru stężeń preparatów białkowych, obliczenia stężenia białka
      (czyli ilości g/l) oraz całkowitej ilości białka w preparacie (stężenie x objętość preparatu). Te same informacje muszą się znaleźć w dzienniku laboratoryjnym, będą potrzebne na kolejnych ćwiczeniach!

3. We wnioskach: porównać własne wyniki z przewidywaną wydajnością (ze 100 l komórek powinno się uzyskać około 2 mg białka w EC i około 600 g białka w 0.4 M EJ), wyjaśnić ewentualne rozbieżności (należy wziąć pod uwagę obrazy mikroskopowe).




Wyszukiwarka