ĆWICZENIE II biol mol, far, III rok IV sem, biologia molekularna, II


ĆWICZENIE II

(05-16.03.2012)

TEMAT: Ekstrakcja kwasów nukleinowych z materiału biologicznego

- zgodnie z instrukcja nr 1

1.Ekstrakcja kwasów nukleinowych:

a.metody ekstrakcji DNA i RNA,

b.celowość zastosowania określonych odczynników w ekstrakcji,

c.postępowanie z odczynnikami szkodliwymi,

d.zasady przechowywania ekstraktów RNA i DNA

e.rozwiązywanie problemów związanych z uzyskaniem dobrej jakości ekstraktów kwasów nukleinowych.

2.Ekstrakcja DNA z komórek z zastosowaniem kolumienek, zgodnie z instrukcją.

3.Zasady zabezpieczania materiału do badań molekularnych.

4.Zasady przechowywania ekstraktów RNA i DNA.

5.Rozwiązywanie problemów związanych z uzyskaniem dobrej jakości ekstraktów kwasów nukleinowych.

6.Inne metody ekstrakcji kwasów nukleinowych

Zagadnienia do przygotowania:

•Powtórzenie wiadomości na temat struktury i funkcji DNA (nukleozydy, nukleotydy, wiązanie fosfodiestrowe, nukleoid, nukleosom).

•Kwasy dezoksyrybonukleinowe (struktury jednoniciowe, struktury dwuniciowe, trójniciowe i czteroniciowe).

•Tautomeria zasad, Reguły Chargaffa

•Sekwencje powtarzające się w DNA (sekwencje typu satelitarnego DNA).

•Struktura chromosomu prokariotycznego.

•Struktura chromosomu eukariotycznego.

•Źródła obecności uracylu w DNA

Zalecana literatura

Słomski R., Analiza DNA teoria i praktyka. Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu 2008. Nazewnictwo wariantów sekwencji DNA RNA i białek str 30-40

Izolacja DNA i RN A str 40-60

Gabryelska MM, Szymański M, Barciszewski J. DNA: Od Mieschera do Ventera i dalej. Postępy Biochemii 2009 tom 55 (3) str 342 - 354

Instrukcja nr 1 do ćwiczenia nr II

(05.03 - 16.03.2012)

Ekstrakcja genomowego DNA z hodowli komórkowejz wykorzystaniem zestawu Genomic Mini

Materiał: komórki wyprowadzone z prawidłowej tkanki nabłonkowej nerki świni (Sus scrofa); linia komórkowa PK-15 (porcine kidney epithelial cell line)

Metoda: izolacja z zastosowaniem minikolumienek przy użyciu zestawu Genomic Mini Kit firmy A&A Biotechnology, Gdynia, Polska

Aparatura: wirówka, worteks, 2 termobloki

Narzędzia pracy: pipety automatyczne (100-1000µl, 20-200µl), statywy na probówki, pojemniki na odpady

Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 1000µl i 200µl, sterylne probówki 1,5 ml i 2 ml

Odczynniki: bufor Tris, bufor LT, proteinaza K, roztwór płuczący A1, ddH2O

Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, okulary ochronne, rękawiczki lateksowe

Opis metody:

•Przygotowanie próbek i rozpoczęcie ekstrakcji DNA

1.Komórki w ilości 1x106 należy odwirować i dokładnie zawiesić w 100 μl buforu Tris.

2.Dodać 200 μl uniwersalnego buforu lizującego LT.

3.Dodać 20 μl roztworu Proteinazy K.

4.Całość wymieszać i inkubować 20 min. w temperaturze 37° C.

5.Przenieść próbkę do 75° C i inkubować 5 min.

6.Próbkę intensywnie worteksować 20 s.

7.Wirować 3 min. przy 10-15 tys. RPM.

8.Pobrać supernatant i nanieść na minikolumnę do oczyszczania genomowego DNA.

9.Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.

10.Wyjąć minikolumnę wraz z probówką i dodać do kolumny 500 μl roztworu płuczącego A1.

11.Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.

12.Przenieść minikolumnę do nowej probówki 2 ml (w zestawie) i dodać do kolumny 400 μl roztworu płuczącego A1.

13.Wirować 2 min. przy 10-15 tys. RPM.

14.Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej probówce 1.5 ml i do złoża znajdującego się na dnie kolumny dodać 30μl wody wolnej od RNaz.

15.Inkubować próbkę przez 5 min. w temperaturze pokojowej.

16.Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.

17.Minikolumnę usunąć, a oczyszczone DNA znajdujące się w probówce przetrzymywać w lodówce do czasu dalszych analiz.



Wyszukiwarka