ĆWICZENIE II
(05-16.03.2012)
TEMAT: Ekstrakcja kwasów nukleinowych z materiału biologicznego
- zgodnie z instrukcja nr 1
1.Ekstrakcja kwasów nukleinowych:
a.metody ekstrakcji DNA i RNA,
b.celowość zastosowania określonych odczynników w ekstrakcji,
c.postępowanie z odczynnikami szkodliwymi,
d.zasady przechowywania ekstraktów RNA i DNA
e.rozwiązywanie problemów związanych z uzyskaniem dobrej jakości ekstraktów kwasów nukleinowych.
2.Ekstrakcja DNA z komórek z zastosowaniem kolumienek, zgodnie z instrukcją.
3.Zasady zabezpieczania materiału do badań molekularnych.
4.Zasady przechowywania ekstraktów RNA i DNA.
5.Rozwiązywanie problemów związanych z uzyskaniem dobrej jakości ekstraktów kwasów nukleinowych.
6.Inne metody ekstrakcji kwasów nukleinowych
Zagadnienia do przygotowania:
•Powtórzenie wiadomości na temat struktury i funkcji DNA (nukleozydy, nukleotydy, wiązanie fosfodiestrowe, nukleoid, nukleosom).
•Kwasy dezoksyrybonukleinowe (struktury jednoniciowe, struktury dwuniciowe, trójniciowe i czteroniciowe).
•Tautomeria zasad, Reguły Chargaffa
•Sekwencje powtarzające się w DNA (sekwencje typu satelitarnego DNA).
•Struktura chromosomu prokariotycznego.
•Struktura chromosomu eukariotycznego.
•Źródła obecności uracylu w DNA
Zalecana literatura
Słomski R., Analiza DNA teoria i praktyka. Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu 2008. Nazewnictwo wariantów sekwencji DNA RNA i białek str 30-40
Izolacja DNA i RN A str 40-60
Gabryelska MM, Szymański M, Barciszewski J. DNA: Od Mieschera do Ventera i dalej. Postępy Biochemii 2009 tom 55 (3) str 342 - 354
Instrukcja nr 1 do ćwiczenia nr II
(05.03 - 16.03.2012)
Ekstrakcja genomowego DNA z hodowli komórkowejz wykorzystaniem zestawu Genomic Mini
Materiał: komórki wyprowadzone z prawidłowej tkanki nabłonkowej nerki świni (Sus scrofa); linia komórkowa PK-15 (porcine kidney epithelial cell line)
Metoda: izolacja z zastosowaniem minikolumienek przy użyciu zestawu Genomic Mini Kit firmy A&A Biotechnology, Gdynia, Polska
Aparatura: wirówka, worteks, 2 termobloki
Narzędzia pracy: pipety automatyczne (100-1000µl, 20-200µl), statywy na probówki, pojemniki na odpady
Sprzęt jednorazowy: sterylne końcówki do pipet na 1000µl i 200µl, sterylne probówki 1,5 ml i 2 ml
Odczynniki: bufor Tris, bufor LT, proteinaza K, roztwór płuczący A1, ddH2O
Zabezpieczenia: fartuchy ochronne, okulary ochronne, rękawiczki lateksowe
Opis metody:
•Przygotowanie próbek i rozpoczęcie ekstrakcji DNA
1.Komórki w ilości 1x106 należy odwirować i dokładnie zawiesić w 100 μl buforu Tris.
2.Dodać 200 μl uniwersalnego buforu lizującego LT.
3.Dodać 20 μl roztworu Proteinazy K.
4.Całość wymieszać i inkubować 20 min. w temperaturze 37° C.
5.Przenieść próbkę do 75° C i inkubować 5 min.
6.Próbkę intensywnie worteksować 20 s.
7.Wirować 3 min. przy 10-15 tys. RPM.
8.Pobrać supernatant i nanieść na minikolumnę do oczyszczania genomowego DNA.
9.Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.
10.Wyjąć minikolumnę wraz z probówką i dodać do kolumny 500 μl roztworu płuczącego A1.
11.Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.
12.Przenieść minikolumnę do nowej probówki 2 ml (w zestawie) i dodać do kolumny 400 μl roztworu płuczącego A1.
13.Wirować 2 min. przy 10-15 tys. RPM.
14.Osuszoną minikolumnę umieścić w nowej probówce 1.5 ml i do złoża znajdującego się na dnie kolumny dodać 30μl wody wolnej od RNaz.
15.Inkubować próbkę przez 5 min. w temperaturze pokojowej.
16.Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.
17.Minikolumnę usunąć, a oczyszczone DNA znajdujące się w probówce przetrzymywać w lodówce do czasu dalszych analiz.