Chromatografia
Oznaczanie związków chemicznych w mieszaninach na ogół musi być poprzedzona procesem rozdzielenia. Jedną z metod rozdzielania jest chromatografia, w której występuje zjawisko podziału składników mieszaniny między fazę nieruchomą (stacjonarną) i ruchomą układu chromatograficznego.
Z uwagi na mechanizm i naturę zjawisk zachodzących podczas rozdzielania chromatografię dzielimy na:1.adsorpcyjną (wykorzystującą zjawisko adsorpcji składników mieszaniny na stałym adsorbencie), 2. podziałową, ( podczas której następuje rozdział między dwie fazy, przy czym fazę stacjonarną stanowi rozpuszczalnik zaadsorbowany na specjalnym nośniku, a fazę ruchomą ciecz lub gaz), 3. jonowymienną (polegającą na wymianie obecnych w roztworze jonów z jonami związanymi chemicznie z jonitem - fazą stacjonarną), 4. żelową (wykorzystuje sita molekularne, na których następuje zatrzymanie cząsteczek o odpowiednich rozmiarach
w porach fazy stacjonarnej).
Z uwagi na stan skupienia fazy ruchomej i nieruchomej rozróżniamy:
- chromatografię gazową adsorpcyjna GSC (faza stacjonarna stała, faza ruchoma gazowa),
- chromatografię cieczowa adsorpcyjna LSC (faza stacjonarna stała, faza ruchoma ciekła),
- chromatografię gazowa podziałowa GLC (faza stacjonarna ciekła, faza ruchoma gazowa),
- chromatografię cieczową podziałową LLC (faza stacjonarna ciekła, faza ruchoma ciekła).
Uwzględniając technikę pracy, chromatografię można podzielić na kolumnową, cienkowarstwową i bibułową.
Mając na uwadze sposób wprowadzania próbki i rozwijania chromatogramu, można mówić
o metodzie:
- wymywania (elucji), polegającej na podaniu próbki na kolumnę, a następnie wymywaniu składników przez dodanie rozpuszczalnika,
- czołowej polegającej na ciągłym wprowadzaniu na kolumnę badanego roztworu,
- rugowania polegającej na jednorazowym wprowadzeniu na kolumnę próbki a następnie wymywaniu składników poprzez wprowadzenie składnika silniej wiążącego się fazą stacjonarną.
Chromatografia cienkowarstwowa TLC i bibułowa PC
Postępowanie w obu metodach składa się z etapów: przygotowania podłoża, naniesienia próbki, rozwijania chromatogramu i wywołania chromatogramu. Właściwe rozdzielenie zachodzi podczas rozwijania chromatogramu. W tym etapie składniki próbki wędrują z różną szybkością wynikającą z różnic w powinowactwie do fazy stacjonarnej, pokonując różne odległości od miejsca startu (naniesienia próbki) do miejsca zlokalizowania plamy podczas wywołania chromatogramu. Odległości te są charakterystyczne dla substancji: Rf=Dsub/Drozp lub RS=Dsub/Dwzorca.
Przygotowanie płytki w chromatografii cienkowarstwowej polega na naniesieniu na podłoże (szkło, folia metalowa, polimer) warstwy adsorbentu (żel krzemionkowy, tlenek glinu, sproszkowana celuloza). Na tak przygotowane płytki lub bibułę nanosi się próbki, najczęściej nakrapiając próbkę za pomocą mikropipet lub rurki kapilarnej, w odległości 2,5 cm od początku płytki (bibuły) i 1 cm od każdego nakropienia. Próbkę najczęściej rozcieńcza się łatwo lotnym rozpuszczalnikiem po nakropieniu suszy strumieniem powietrza. Chromatogramy rozwija się w komorach chromatograficznych techniką wstępującą (rozpuszczalnik porusza się w górę płytki, bibuły) i zstępującą. Rozpuszczalnik lub ich mieszaniny dobiera się indywidualnie do każdej metody. Ostatnim etapem chromatografii planarnej jest wywołanie chromatogramu polegające na uwidocznieniu rozdzielonych składników mieszaniny, np. naświetlanie promieniowaniem UV (większość związków organicznych absorbuje promieniowanie UV) lub reakcję z parami jodu (związki organiczne nienasycone) lub stosowanie odczynników, z którymi składniki mieszaniny tworzą barwne związki.
Chromatografia planarna znalazła zastosowanie w biochemii (analiza białek
i aminokwasów), analizie klinicznej, farmaceutycznej i kryminologii.
Chromatografia gazowa
Rozdzielanie mieszanin w chromatografii gazowej prowadzi się w chromatografach gazowych. Próbkę najczęściej ciekłą (lub gazową) wprowadza się do komory nastrzykowej (dozownika) za pomocą strzykawki chromatograficznej, gdzie następuje odparowanie substancji. Za pomocą obojętnego gazu nośnego mieszanina zostaje przeniesiona do kolumny chromatograficznej (metalowa, szklana lub teflonowa rurka wyprofilowana w kształcie litery
W lub zwinięta w spiralę). Kolumna zawiera fazę stacjonarną (adsorbent: żel krzemionkowy, zeolity, węgiel aktywny, polimery lub ciecz naniesiona na stały obojętny nośnik), na której następuje rozdzielenie składników (na powierzchni fazy stacjonarnej następuje adsorpcja składników próbki. Substancje wykazujące większe powinowactwo do fazy stacjonarnej przemieszczają się przez kolumnę wolniej niż składniki słabiej związane przez wypełnienie. Substancje po wyjściu z kolumny chromatograficznej kierowane są do detektora, który reaguje na obecność i ilość substancji obcej w gazie nośnym. Detektor termokonduktometryczny (katarometr) dokonuje pomiaru przewodnictwa cieplnego gazu wychodzącego z kolumny. Detektor płomieniowo-jonizacyjny mierzy oporność atmosfery płomienia palnika wodorowego, między dwoma elektrodami platynowymi (substancja organiczna rozpada się karbojony, które przepływają do elektrod, pobudzając przepływ prądu elektrycznego). Detektor płomieniowo-emisyjny atomizuje próbkę, atomy ulegają wzbudzeniu i emitują promieniowanie,
a fotopowielacz dokonuje pomiaru jego natężenia.
Identyfikacja związków metodą chromatografii gazowej opiera się na porównywaniu danych retencyjnych (czasu retencji - czasu upływającego od nastrzyku próbki do pojawienia się na chromatografie maksimum piku odpowiadającemu temu związkowi) substancji analizowanych i wzorców. W celu przeprowadzenia oznaczenia jakościowego wykonuje się w identycznych warunkach chromatogramy badanej próbki i wzorca. Brak na chromatografie próbki piku odpowiadającego pikowi wzorca oznacza, że nie zawiera on substancji wzorcowej. Gdy do badanej próbki dodamy wzorca wówczas obserwujemy wzrost natężenia piku badanej substancji, jeżeli próbka zawiera substancje wzorca. Ponieważ istnieją różne substancje o takim samym czasie retencji, badanie należy przeprowadzić na innej kolumnie lub korzystając
z innego detektora.
Podstawą analizy ilościowej jest liniowa zależność pola powierzchni piku (wysokości piku) od stężenia oznaczanej substancji. Do oznaczeń wykorzystuje się metodę krzywej wzorcowej (kalibracyjnej).
Wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC
Rozdzielenie składników mieszaniny odbywa się miedzy dwoma fazami ciekłą (próbka)
i stacjonarną (adsorbent) w chromatografie cieczowym. Aparat wyposażony jest w dwa zbiorniki rozpuszczalników. Każdy z zbiorników zaopatrzony jest w komorę odgazowania,
w której usuwa się z rozpuszczalników rozpuszczone powietrze. Dwa rozpuszczalniki są mieszane w komorze mieszania, a następnie ogrzewane. Mieszania przechodzi przez kolumnę wstępną, gdzie nasyca się nieruchomą fazą ciekłą. Strumień rozpuszczalnika zostaje podzielony na dwie części. Pierwsza kierowana jest do komory porównawczej detektora (odnośnik - ślepa), druga łączy się z badaną próbką (po jej wstrzyknięciu) i kieruje do kolumny analitycznej (wykonanej z stali kwasoodpornej lub szkła na powierzchni, których nanosi się adsorbent: żel krzemionkowy, tlenek glinu lub nośnik fazy ciekłej - ziemię okrzemkową), gdzie następuje rozdzielenie składników mieszaniny. Po rozdzieleniu składniki identyfikuje detektor. Może być to detektor spektrofotometryczny (mierzy absorpcję promieniowania UV-ViS przez składniki mieszaniny), refraktometryczny lub polarograficzny.
Analiza jakościowa i ilościowa przebiega jak w chromatografii gazowej.